支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測聯合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結核的價值研究

陳廷憲 黃祖軍 陳勇毅

培養法診斷結核具有較長時間周期，并且陽性率一直不高，在肺結核的診斷上顯得相對遲緩。近年來，分子生物學得到了迅速的發展，核酸擴增等技術也在結核的診斷中得以應用，但因種種缺陷的存在，其靈敏度、特異性也不是十分理想，因此，采取有效措施，更加快捷、準確、有效地診斷結核病，顯得十分重要。本研究前瞻性擬選取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌陰肺結核患者60 例作為研究組，另選取非結核性疾病患者60 例非結核受試者作對照組，均進行支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）結核桿菌檢測及T 細胞酶聯免疫斑點試驗（T-SPOT.TB），分析支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測聯合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結核的臨床價值，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2018 年12 月—2019 年12 月收治的菌陰肺結核患者60 例作為研究組，納入標準：抗結核治療有效；以發熱、咳嗽、咳痰、咯血、胸痛等非特異性癥狀就診，無典型肺結核表現，干咳無痰或痰涂片抗酸染色陰性，快速培養無結核菌生長。研究組排除標準：排除其他非結核疾病。所有患者支氣管鏡檢查前涂片找抗酸桿菌3 次陰性，1 次培養陰性。另選取非結核性疾病患者60 例非結核受試者作對照組。對照組中，女性17 例（28.33%）、男性43 例（71.67%）；年齡17 ～76 歲，平均年齡（52.15±13.41）歲。研究組中，女性15 例（25.00%）、男性45 例（75.00%）；年齡16 ～76 歲，平均年齡（51.62±11.57）歲。兩組一般資料對比，差異無統計學意義（P ＞0.05）。

1.2 方法

所有研究對象均進行BALF結核桿菌檢測及T-SPOT.TB試驗。比較T-SPOT.TB 試驗及支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測單獨使用及聯合檢測時診斷敏感度、特異度、診斷效率、陽性預測值、陰性預測值。（1）T-SPOT.TB 試驗：采用酶聯免疫斑點試驗，使用結核感染T 細胞檢測試劑盒，依照說明進行操作，分離制備人外周血單個核細胞，制成工作濃度細胞懸液，并連同抗原一同加至微孔培養板，在37.0℃和5%CO2培養環境下過夜，洗滌培養板并且滴加酶標抗體，再洗滌培養板后滴加底物反應液，進行SPOT計數，依照抗原A 或/和抗原B 孔反應情況，對結果作出判斷：當陰性對照孔SPOT 數在0 ～5 之間時，陽性樣本應為：（抗原A或抗原B 的SPOT 數）-（陰性對照孔SPOT 數）≥6；當陰性對照孔SPOT 數等于或超過6 時，陽性樣本應為：（抗原A 或抗原B 的SPOT 數）≥2×（陰性對照孔SPOT 數）。（2）BALF 結核桿菌檢測：根據患者病變部位對灌洗肺段加以選擇，插入纖維支氣管鏡頂端至選好的肺段或亞段支氣管開口位置，由活檢孔給予2%利多卡因2 ～3 mL，局麻后再行注入37.0℃的生理鹽水，共注入10 ～20 mL 生理鹽水，注入完畢后立即吸引并回收BALF，可重復進行2 ～3 次并共收集15 mL 灌洗液。①BALF 涂片，采用萋-尼氏抗酸染色法，找到≥3 個抗酸桿菌/300 視野即判斷為陽性；②使用羅氏固體培養法進行BALF 結核菌分離培養。③應用實時熒光定量核酸擴增（Xpert MTB/RIF）法檢測灌洗液中結核分枝桿菌DNA。

1.3 觀察指標

比較T-SPOT.TB 試驗 及支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測單獨使用及聯合檢測時診斷敏感度（即真陽性率）。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計學分析，以例（%）表示計數資料，采用χ2檢驗，以（）表示計量資料，采用t 檢驗，并P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

60 例菌陰肺結核患者中，抗酸桿菌涂片陽性11 例，陽性率18.33%；結核菌培養（羅氏法）陽性31 例，陽性率51.67%；肺泡灌洗液TB-DNA 陽性49 例，陽性率81.67%，TB-DNA 陰性11 例中，4 例結核菌培養或抗酸桿菌涂片陽性。灌洗液抗酸桿菌涂片、培養、TB-DNA 三項聯合檢測，病原學總陽性率（49+4）/60=88.33%。60 例菌陰肺結核患者中，T-SPOT 陽性59 例，陽性率98.33%，T-SPOT 陰性1 例，陰性率1.67%。60 例非結核性疾病患者中，T-SPOT 陽性3 例（5.00%），陰性57 例（95.00%）。研究組T-SPOT 陽性率明顯高于對照組（P ＜0.01）。T-SPOT.TB試驗及支氣管肺泡灌洗液結核桿菌聯合檢測提高了診斷敏感度，詳見表1、表2。

3 討論

肺結核曾經嚴重危害我國人民群眾，且近年來耐藥菌的問題日益嚴重。涂陽肺結核大約僅為發病例數的50%，菌陰肺結核的人數逐漸上升，給臨床早期確診和及時有效治療造成了一定的困擾[1-2]。近年來，分子生物學取得飛速的發展，核酸擴增等技術的發展也很快，并且已經在結核診斷中有了一定的應用，但目前僅靠該類實驗方法還難以達到很高的檢測靈敏度和特異性[3-4]。

支氣管鏡檢查作為一種輔助診斷肺結核的重要手段，能夠直接獲取細菌學依據，通過BALF 直接在病灶支氣管肺泡內取材，使得檢出結核分枝桿菌的機會增加，即使無痰的病例也可藉此進行檢測[5-6]。T-SPOT.TB 試驗是一種依靠特異性抗原，以酶聯免疫斑點技術對結核進行診斷的新技術，資料顯示其敏感性及特異性較高，它不會受到環境分枝桿菌或卡介苗接種的影響，并且受到患者免疫抑制的影響很小，即使HIV 感染的患者也依然適用，且其操作方法簡便，檢測周期較短，24 h 之內一般可獲得檢測報告，因此在臨床上日益得到廣泛的應用，在各類肺結核患者中均有應用[7-8]。因為支氣管鏡檢查在臨床上的應用非常廣泛，因而對于肺結核的診斷，也提供了極有價值的參考[9-12]。結合通過電子支氣管檢查獲得BALF，再通過相應方法來進行核酸檢測，可使診斷的陽性率得到進一步提高，如廖明等[13]選擇86 例疑似肺結核患者進行T-SPOT.TB、BALF-TbDNA、BALF 涂片、痰涂片、PPD、結核抗體檢測，并對于T-SPOT.TB 與BALF-TbDNA 聯合檢測與單用檢測、涂片法、PPD、結核抗體檢測結果進行對比分析，結果血T-SPOT.TB、BALF-TbDNA 敏感性分別為84.8%、80.4%，特異性分別為80.0%、77.5%，兩者聯合檢測敏感性達到100.0%，陽性預測值達97.1%，陰性預測值達100.0%，均優于單用檢測（P ＜0.05），50 例肺結節病和123 例肺結核患者進行T-SPOT 和肺泡灌洗液T細胞亞群檢測，結果肺結節病患者中T-SPOT 陽性率為4.0%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 細胞百分比分別為（88.79±5.34）、（63.58±20.56）、（27.42±6.76）%，CD4+/CD8+比值為（2.32±2.00）；肺結核患者中T-SPOT 陽性率為90.2%，肺泡灌洗液CD3+、CD4+、CD8+T 細胞百分比分別為（75.10±11.20）、（44.52±7.30）、（32.10±12.30）%，CD4+/CD8+比值為（1.30±1.20）。肺結節病患者較肺結核患者CD3+和CD4+T 細胞明顯增多，CD4+/CD8+比值升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05），CD8+T 細胞有所下降，但差異無統計學意義（P ＞0.05）；肺結核患者T-SPOT 陽性率明顯高于肺結節病患者，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。

表1 各檢查方法在各組中的結果（例）

表2 各檢查方法在60 例菌陰肺結核患者中的診斷敏感度對比 [例（%）]

本文則探討了支氣管肺泡灌洗液結核桿菌檢測（同時行抗酸桿菌涂片、培養、核酸檢測）聯合T-SPOT.TB 試驗診斷菌陰肺結核的價值，以期提高痰涂片及培養陰性的肺結核患者的結核分枝桿菌檢出率，為菌陰肺結核的診斷提供依據。結果表明，聯合檢測較上述單獨檢查的診斷敏感度有顯著提升（P＜0.01）。

綜上所述，T-SPOT.TB 試驗及支氣管肺泡灌洗液結核桿菌聯合檢測提高了診斷敏感度，值得進一步研究、推廣。