脈沖場凝膠電泳對不同牛舍中大腸桿菌的分析鑒定

文/李慶雷 王金新 劉 鵬 付 嵩 馬 馳

（山東高速生物工程有限公司）

2020年初，一場史無前例的新冠肺炎疫情嚴重影響了全球，公共生物衛生安全引起重大關注，未來，生物安全極有可能越來越頻繁地威脅人類公共衛生安全。生物安全防控過程中，最難控制的傳播途徑就是病原微生物的氣溶膠傳播，尤其是導致人畜共患病的病原菌傳播控制難度大，危害性強。

現代集約化奶牛場中，奶牛糞便中的微生物擴散到空氣中，形成微生物氣溶膠，具有濃度高、分布廣、擴散快的特征，能導致氣源性傳染病的傳播，嚴重威脅工作人員健康、奶牛生產性能及健康[1]，甚至導致某些傳染病的暴發流行。在奶牛養殖生產中，大腸桿菌引起的奶牛疾病較常見[2]，奶牛乳房炎和犢牛腹瀉等疾病都與大腸桿菌感染密切相關[3]，對牧場造成了極大的經濟損失，且大腸桿菌還是人畜共患病原菌，因此，對大腸桿菌氣溶膠傳播方式的研究非常重要。

本文分別在泌乳牛舍、青年牛舍和犢牛舍收集空氣樣品，進行分離培養，利用脈沖場凝膠電泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）[4]技術對采集到的大腸桿菌進行同源性分析[5]，探討大腸桿菌的來源，分析奶牛舍之間大腸桿菌氣溶膠的傳播方式。

1 材料和方法

1.1 空氣樣品采集

2019年10月，從山東濟南某現代化奶牛場采集樣品，該奶牛場有8 棟開放式牛舍。開放式奶牛舍長110.0 m，寬27.0 m，高6.0 m，舍內溫度為15～23 ℃，濕度為48%～57%，每日機械清理糞便5次，舍外溫度為15～23 ℃，濕度為46%～54%，風速為0。分別對其中1 棟泌乳牛舍（飼養奶牛240 頭）、1 棟發育牛舍（飼養6～14 月齡奶牛280 頭）和1 棟犢牛舍（飼養3～6月齡奶牛320 頭）采集空氣樣品。

1.2 氣載大腸桿菌的收集

采用Andersen-6級[6]空氣微生物樣品收集器，氣流速度28.3 L/min，設置于奶牛舍中央，采樣時間5 min，重復采樣5 次。

1.3 糞便中大腸桿菌的分離與鑒定

無菌收集新鮮的糞便樣本每舍15 個，取1 g糞便，放入盛有9 mL滅菌生理鹽水中稀釋，后接種到麥康凱3號培養基，37 ℃過夜培養[7]，再從每個平板中挑取典型紅色菌落[8]，選用麥康凱3號培養基為采樣介質[9]，樣本在37 ℃條件下培養48 h后，然后用API 20 E（Bio Merieux，Marcy-I，Etoile，France）鑒定大腸桿菌，最后將其放入含30%甘油的肉湯培養物中，-20 ℃保存[10]。

圖1 PFGE鑒定圖

1.4 對不同來源大腸桿菌進行PFGE分型

參照美國CDC PulseNet USA對大腸桿菌分型的方法進行脈沖場凝膠電泳[11]。首先制成細菌包埋塊，在54 ℃條件下細胞裂解2 h后，在37 ℃ XbaI酶切2 h，使用CHEF Mapper電泳儀，在1%SeaKem Gold Agarose（Lonza Rockland，ME USA）（Pharmacia Biotech）上跑電泳。電泳條件為溫度14 ℃，角度120°，脈沖時間5～60 s，電壓6 V/cm，電泳時間18 h[12]。電泳結束后，用紫外成像系統（Tanon-2500）拍照并保存。

圖2 大腸桿菌PFGE分析圖

2 結果

2.1 PFGE 電泳圖片

在采集的空氣樣品和糞便樣品中總計分離到9 株大腸桿菌，經過PFGE電泳后，紫外凝膠成像儀上記錄下的PFGE凝膠圖片見圖1。

2.2 PFGE 結果判定

對于圖1，利用計算機分析軟件（Tanon-2500）記錄下擴增及電泳譜帶。每個樣品的擴增帶存在時，賦值為“1”；不存在時，賦值為“0”，用電泳圖象分析軟件（Gel Image System，Version 4.00）進行分析后自動生成矩陣圖。運用非加權對數算術平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA），采用NTSYS-pc 2.10[13]軟件構建聚類樹狀圖（圖2）。

由于細菌存在合理的變異性，判斷不同來源的菌株是否為同一菌株時允許有一定的變異存在。Tenover等[14]提出了有關菌株同源性的判別標準，按其電泳條帶可分為：無差異， 說明為相同菌株；有1～3 條帶的差異說明菌株間有相近關系，且只有單基因的改變；4～6 條帶的差異說明菌株間可能有相近關系，表示出有2 個獨立基因的差異；如菌株間有6 條帶或更多條帶差異，說明有3 個或更多基因的變化，被視為無相關性。該標準只適合于小量的局部性基因的變化研究，有一定的局限性。Tenover等在解釋PFGE結果時提出將具有85%以上相同條帶的菌株認為是相同的菌株，50%以上的條帶不相同時，菌株被認為流行病學不相關。

從圖1可以看出，有6 株菌株同源性高于85%，據此判定具有同源性，說明大腸桿菌可以從糞便中傳播到空氣中，進而在牛舍之間傳播。

3 討論

3.1 空氣微生物采樣方法

采用國際通用的微生物氣溶膠收集器，ANDERSEN-6級收集器收集空氣中的微生物氣溶膠，可采集到的粒譜范圍在0.2～20.0 m，采集到的活粒子數多，敏感性高，是一種非常準確、有效的氣載微生物采樣方法。

3.2 同源性分析方法

以聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）為基礎的分子生物學分型技術，在微生物同源性分析上被應用，比如隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）、細菌基因組重復序列PCR技術（Rep-PCR）、腸桿菌基因間重復共有序列PCR技術（Eric-PCR）、多重PCR技術（Multiplex-PCR）等，省時、省力、簡單、快速且成本低，且對實驗操作和儀器試劑要求不高，因此，被廣泛應用到多種細菌的分型中。然而這些方法的分辨率以及重復性很難區分遺傳關系相近的菌株[10，15～17]。近幾年，PFGE以其重復性好，分辨力強而被譽為細菌分子生物學分型技術的“金標準”[18～20]，在分型上的應用越來越廣泛。Moissenet（1996）[18]、Stewart（1995）[19]等均已證實PFGE的分辨率和重復性遠遠高于ERIC-PCR等以PCR為基礎的分子生物學分型技術，是鑒定病原微生物氣源性傳播的較理想技術。鑒于此，對不同來源的菌株進行PFGE分型，比較其遺傳相似性，認知細菌的來源，從根本上確認奶牛舍之間微生物氣溶膠傳播方式。

4 小結

大腸桿菌在奶牛舍及其周圍環境中是一種常見菌。Hojovec等（1977）[8]曾將大腸桿菌作為評估畜禽舍空氣質量的指示細菌。運用PFGE分型方法，通過比較泌乳牛糞便和不同牛群舍內氣載大腸桿菌的同源性發現，從泌乳牛的糞便中分離的大腸桿菌與泌乳牛舍和小牛舍空氣中分離到的大腸桿菌有2 株（占總數量23%）相似性可達85%以上，因此，推測奶牛糞便中的大腸桿菌可以形成氣溶膠污染奶牛舍空氣。但是，某些從舍內空氣中分離到的大腸桿菌與糞便中的相似性較小，出現這種結果一方面，可能是舍內分離到的大腸桿菌確實不是來源于糞便；另一方面，采集的糞便樣本有限，沒有分離到與空氣中同源的大腸桿菌；或者是這些大腸桿菌來源于其他方面，如飼料、墊料或飲水等。

結果表明，從泌乳牛的糞便中分離的大腸桿菌能夠對環境造成生物污染，在泌乳牛舍中形成環境微生物氣溶膠，并隨空氣傳播，對奶牛環境性疾病的防控及環境消毒具有理論指導作用，并具有公共衛生學意義。