多管發酵法和酶底物法檢測總大腸菌群的結果差異性

樓小平，林增飛

(寧波市自來水有限公司，浙江寧波 315000)

多管發酵法、酶底物法都是生活飲用水標準檢驗方法中規定的檢測總大腸菌群的方法，其中多管發酵法為仲裁法。多管發酵法檢測步驟多，耗時長，一次典型的檢測需3 d；而酶底物法檢測方便，耗時短，一般能在24 h出結果，對檢測人員的專業技能要求低。因此，很多人傾向于選擇后者，但在實際工作中普遍存在困擾：兩種檢測方法的檢測結果經常表現出較大的差異。本文采用兩種檢測方法檢測不同類型的樣品，對檢測結果進行了比較分析，并對造成結果差異的原因做了進一步研究和探討。

1 試驗方法與材料

1.1 試驗方法

(1)多管發酵法：《生活飲用水標準檢驗方法》(GB 5750.12—2006)2.1節。

(2)酶底物法：《生活飲用水標準檢驗方法》(GB 5750.12—2006)2.3節中的51孔法。

(3)菌種鑒定：細菌16S rDNA基因測序鑒定方法，實驗室分離純化后送浙江天科高新技術發展有限公司鑒定。

(4)靈敏度測試：大腸埃希氏菌標準菌CICC 23657、陰溝腸桿菌標準菌 CICC 21539的新鮮培養物用無菌生理鹽水稀釋，然后吸取1 mL稀釋樣品分別接種到乳糖蛋白胨單倍培養基、MMO-MUG培養基試管中培養觀察，同時，以平板計數方法對接種量進行定量。MMO-MUG培養基試管制備：取MMO-MUG培養基1支，用90 mL無菌生理鹽水溶解混勻后分裝成10支試管，每支9 mL。

1.2 儀器與試劑

營養瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)、乳糖蛋白胨培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)、伊紅美藍瓊脂培養基(廣東環凱微生物科技有限公司)、MMO-MUG培養基(IDEXX公司)、程控定量封口機、渦旋振蕩器、大腸埃希氏菌標準菌CICC 23657(中國工業微生物菌種保藏中心)、陰溝腸桿菌標準菌CICC 21539(中國工業微生物菌種保藏中心)。

2 結果與討論

2.1 兩種方法檢測生活飲用水樣品

共檢測72個樣品，樣品來源包括管網水、末梢水、二次供水，結果如表1所示。

表1 生活飲用水樣品比對結果 Tab.1 Comparison Results of Drinking Water Samples

2.2 兩種方法檢測污染樣品

污染樣品檢測結果如表2所示。

表2 污染樣品比對結果 Tab.2 Comparison Results of Contaminated Water Samples

注：1～11號樣品為水廠進口水源水；12～19號樣品為城市內河水用生理鹽水稀釋100倍

2.3 兩種方法檢測大腸埃希氏菌加標樣品

加標樣品以大腸埃希氏菌標準菌CICC 23657新鮮培養物用無菌生理鹽水稀釋制備，結果如表3所示。

表3 大腸埃希氏菌加標樣品比對結果Tab.3 Comparison Results of Escherichia coli Spiked Samples

2.4 靈敏度測試

靈敏度測試結果如表4所示。

表4 靈敏度測試比對結果Tab.4 Comparison Results of Sensitivity Tests

注：大腸埃希氏菌CICC 23657每種濃度平行接種5管；陰溝腸桿菌CICC 21539每種濃度平行接種3管；接種量由平板計數法進行定量(雙平板讀數)；“+”表示陽性，“-”表示陰性

2.5 討論

2.5.1 不同類型樣品的檢測結果分析

對19份污染樣品檢測結果(表2)作對數處理后進行配對t檢驗，P<0.05，檢測結果有顯著性差異。對大腸埃希氏菌加標樣品進行了兩組比對(表3)，比對一組的結果對數處理后進行配對t檢驗，P>0.05，檢測結果無顯著性差異；比對二組進行了重復性測試，兩種方法的結果均值分別為51 MPN/(100 mL)和49 MPN/(100 mL)，再次驗證了兩者結果的一致性。72份生活飲用水樣品檢測結果(表1)顯示，兩種檢測方法結果均為陰性，無法比較兩種檢測方法的結果差異。兩種方法檢測不同類型樣品，其結果的差異性表現有所不同，而方法的特異性、靈敏度是微生物檢測影響結果的重要因素，以下為具體分析內容。

2.5.2 方法特異性

總大腸菌群一般是指一群能在35～37 ℃條件下24～48 h發酵乳糖產酸產氣需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要包括埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬[1]。《生活飲用水衛生標準》(GB 5750.12—2006)中酶底物法對總大腸菌群的定義是指能在選擇性培養基上產生β-半乳糖苷酶的細菌群組。微生物發酵乳糖主要依靠乳糖滲透酶、β-半乳糖苷酶的參與。β-半乳糖苷酶在動物組織、植物和微生物中廣泛存在[2]。王維梅等[3]曾對β-半乳糖苷酶檢測腸桿菌的特異性進行了研究，通過3次重復檢測克雷伯氏菌，均得到了陰性結果。本實驗室從兩種方法結果差異較大的樣品中分離出兩株菌株，經重復測試，乳糖蛋白胨培養24～72 h，陰性(無明顯產酸產氣)；MMO-MUG培養24 h，陽性，經細菌16S rDNA基因測序鑒定為桑樹腸桿菌Enterobactermori(R18-2)、路氏腸桿菌Enterobacterludwigii(EN-119)；乳糖蛋白胨對這兩種腸桿菌未表現出特異性。由此可見，兩種方法對總大腸菌群的定義有區別，兩種方法檢測的目標菌也存在一定的差異。總大腸菌群作為糞便污染指示菌，從來不是細菌分類學上的單一屬種，酶底物法在國際上得到廣泛應用。

表2中，水廠進口水源水大腸埃希氏菌含量明顯比城市內河水稀釋樣低，污染程度相對較低，酶底物法與多管發酵法檢測結果的比值相應地比后者高，最高甚至達到了400倍，而內河水稀釋樣最高只有6倍。王晉宇等[4]曾對長江水域地表水樣品和太湖水域地表水樣品進行比對，結果顯示長江水域地表水樣品檢測結果無統計意義上的差異，而太湖水域地表水樣品的檢測結果有較大的區別(多管發酵法基本未檢出)。因此，兩種方法檢測結果的差異大小可能與檢測樣品的污染程度有一定關聯，不同污染程度樣品的細菌種類組成不同。而表1中兩種方法檢測72份生活飲用水樣品的結果均為陰性，其中5份樣品的菌落總數達300～580 CFU/mL，這可能與生活飲用水樣品經消毒處理后細菌種類組成相對簡單有關。

2.5.3 方法靈敏度

靈敏度是指從眾多菌中檢測到目標菌的能力，參考《食品微生物檢驗方法確認技術規范》(SNT 3266—2012)。本試驗只考察了兩種方法培養基對大腸埃希氏菌CICC 23657、陰溝腸桿菌(CICC 21539)的檢測表現。表4在相同的接種量下(接種量用平板計數法定量，表中結果為兩個平板的讀數)，乳糖蛋白胨和MMO-MUG培養基對大腸埃希氏菌的靈敏性未表現出差異，產生陽性結果的時間(培養時間為18 h以上)和陽性管數均較為一致。對于陰溝腸桿菌，在接種量為8～28 CFU時，乳糖蛋白胨在培養時間為18 h時就已經有明顯的陽性結果。而MMO-MUG培養基在培養28 h后還沒有陽性結果(培養時間為48 h時有明顯的陽性結果)，對陰溝腸桿菌(CICC 21539)表現出較明顯的遲滯效應，靈敏度弱于多管發酵法的乳糖蛋白胨。這與王晉宇等[4]的試驗結果有明顯的差異，他們發現陰溝腸桿菌(CICC 22927)接種量為200 MPN/100 mL以下時，多管發酵法具有明顯的發酵延遲現象，這是否是由于試驗所用的陰溝腸桿菌菌株不同需進一步驗證。另外，楊毓環等[5]也曾檢出乳糖發酵遲緩的產氣腸桿菌。在實際樣品檢測中，靈敏度還可能會受到更多因素的影響，比如不同類細菌之間的競爭。

3 結論

(1)多管發酵法和酶底物法檢測總大腸菌群結果差異的大小與樣品的細菌種類組成有關，而多管發酵法和酶底物法檢測原理的不同導致檢測的目標菌有一定的差異，是兩者結果差異的根本原因。

(2)酶底物法對腸桿菌屬中的桑樹腸桿菌、路氏腸桿菌有特異性，而多管發酵法未表現出特異性。酶底物法對陰溝腸桿菌(CICC 21539)的靈敏性不如多管發酵法，表現出較明顯的遲滯效應。

(3)酶底物法在檢測時效性、便捷性上具有不容忽視的優點，可作為生產企業檢測控制手段，但如果用作產品合格檢驗或仲裁檢測時應慎重，統一總大腸菌群定義是當前急需解決的問題。