阿膠強骨口服液連續逆流提取工藝研究

古孜麗阿依·庫爾班，黃 卉，陳 偉，朱倩蘭，武嘉林,*

(1.新疆醫科大學中醫學院，新疆 烏魯木齊830011； 2.新疆華世丹藥業股份有限公司，新疆 烏魯木齊830011； 3.新疆華世丹藥物研究有限責任公司，新疆 烏魯木齊830011)

阿膠強骨口服液是新疆華世丹藥業股份有限公司生產的治療原發性骨質疏松癥的復方制劑，由熟地黃、黃芪、黨參、枸杞、阿膠、牡蠣等6味藥材組成。目前，阿膠強骨口服液采用傳統的加熱回流提取技術，存在提取時間長、能耗大、溶劑用量大和回收率低等缺點。連續逆流提取技術是使溶劑和藥材反方向流動，兩者逆流接觸，濃度梯度可以始終保持在較高水平，確保連續而充分的接觸提取，具有浸出速度快、提取效率高、能耗小等特點[1-4]。作者采用連續逆流提取技術代替傳統的加熱回流提取工藝，以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標，采用多指標綜合評分法結合正交實驗，優化阿膠強骨口服液連續逆流提取工藝。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

黃芪(批號190802，哈巴河)、黨參(批號190808，甘肅)、枸杞子(批號190801，精河)、熟地黃(批號190401，河南)、阿膠(批號19030112，山東)、牡蠣(批號1908001，東北)，百草堂公司；阿膠強骨口服液(批號18101402、18100501)，新疆華世丹藥業股份有限公司；黃芪甲苷(110781-201717)、毛蕊花糖苷(111530-2017-13)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷(111920-201606)、D-無水葡萄糖(110833-201707)，中國食品藥品檢定研究院。

三氯甲烷，分析純，天津北聯精細化學開發有限公司；正丁醇、硫酸，分析純，成都科隆化學品有限公司；氨水，分析純，四川西隴科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜級，賽默飛世爾科技有限公司；甲酸，分析純，天津福晨化學試劑廠；冰乙酸，分析純，天津永晟精細化工有限公司；苯酚、無水乙醇，分析純，天津百世化工有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀、UV-2600型紫外可見分光光度計，日本島津；蒸發光散射器，天津埃文森；CPA225D型電子分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；Smart-S15UV型超純水器，上海和泰儀器有限公司；SK3300LHC型超聲波清洗器，上海科導超聲儀器有限公司；連續逆流提取小機，江蘇沙家浜醫藥化工裝備股份有限公司；XMTD-7000型電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫療儀器有限公司；GENIUS 4K型臺式低速離心機，長沙鑫奧儀器儀表有限公司。

1.2 毛蕊花糖苷含量測定[5-6]

1.2.1 標準溶液的制備

精密稱取適量毛蕊花糖苷標準品，加入甲醇溶解，搖勻，制成0.268 mg·mL-1的毛蕊花糖苷標準溶液，冷藏，備用。

1.2.2 供試溶液的制備

精密量取10 mL阿膠強骨口服液置于具塞錐形瓶中，加入20 mL甲醇，超聲10 min后，冷卻，過濾；濾液經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.2.3 色譜條件

Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%醋酸溶液(16∶84，體積比，下同)，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長334 nm。

1.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定[7]

1.3.1 標準溶液的制備

精密稱取適量毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準品，加入甲醇溶解，搖勻，制成0.251 5 mg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液，冷藏，備用。

1.3.2 供試溶液的制備

精密量取5 mL阿膠強骨口服液置于25 mL容量瓶中，加入甲醇，定容至刻度，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.3.3 色譜條件

Welch Ultimate XB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸溶液(B)，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃，檢測波長260 nm。梯度洗脫條件見表1。

表1梯度洗脫條件

Tab.1 Gradient elution conditions

1.4 黃芪甲苷含量測定

1.4.1 標準溶液的制備

精密稱取黃芪甲苷標準品12.5 mg置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，充分混勻，制成0.5 mg·mL-1的黃芪甲苷標準溶液。

1.4.2 供試溶液的制備

精密吸取阿膠強骨口服液10 mL置于分液漏斗中，分別用40 mL、30 mL三氯甲烷萃取2次，棄去下層；分別用40 mL、40 mL、30 mL、20 mL水飽和的正丁醇萃取4次，收集合并正丁醇液(上層)；再分別用50 mL、40 mL氨試液洗滌2次，棄去氨水層(下層)；正丁醇液減壓回流，濃縮至干，冷卻，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL容量瓶中，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試溶液。

1.4.3 色譜條件

Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，蒸發光散射器檢測，流動相為乙腈-水(38∶62)，漂移管溫度105 ℃，流速3.0 L·min-1，撞擊器關閉，理論塔板數按黃芪甲苷計算不低于4 000，進樣量10 μL。

1.5 總多糖含量測定[8-12]

1.5.1 標準溶液的制備

精密稱取10 mg D-無水葡萄糖標準品置于100 mL容量瓶中，加水溶解，并定容至刻度，搖勻，即得0.1 mg·mL-1的D-無水葡萄糖標準溶液，冷藏，備用。

1.5.2 供試溶液的制備

精密吸取阿膠強骨口服液1 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。精密量取0.5 mL，加無水乙醇9.5 mL，4 000 r·min-1離心15 min，傾去上清液，加純化水溶解沉淀，并定容至25 mL容量瓶中，即得供試溶液。

1.5.3 5%苯酚溶液的配制

精密稱取苯酚固體5.0 g，加水溶解，定容至100 mL棕色容量瓶中，搖勻，即得5%苯酚溶液。

1.5.4 測定方法

精密吸取供試溶液2.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻；迅速加入硫酸5.0 mL，搖勻，靜置10 min；40 ℃水浴鍋中保溫15 min，取出，迅速置于冷水中冷卻至室溫，以相應的試劑為空白，在波長490 nm處測定吸光度。

1.6 連續逆流提取工藝正交實驗優化[13-15]

在前期預實驗以及原工藝的基礎上，以料液比(g∶mL，下同)、乙醇體積分數、提取時間及提取溫度為考察因素，以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為評價指標，進行L9(34)正交實驗，設定其加權平均數均0.2，采用綜合加權評分法，優化阿膠強骨口服液連續逆流提取工藝。正交實驗的因素與水平見表2。

表 2正交實驗的因素與水平

Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結果與討論

2.1 毛蕊花糖苷含量測定方法學考察

2.1.1 高效液相色譜圖

取毛蕊花糖苷標準溶液及供試溶液按1.2.3色譜條件進樣，結果見圖1。

圖1 毛蕊花糖苷標準溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectra of verbascoside standard solution(a) and test solution(b)

2.1.2 線性關系

分別取268 μg·mL-1、134 μg·mL-1、67 μg·mL-1、33.5 μg·mL-1、16.75 μg·mL-1、8.375 μg·mL-1的毛蕊花糖苷標準溶液，按1.2.3色譜條件進樣，測定峰面積，以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，擬合得線性方程為：y=13088x+6196.3(R=0.9995)。表明毛蕊花糖苷濃度在8.375～268 μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.1.3 精密度

精密吸取134 μg·mL-1毛蕊花糖苷標準溶液，按1.2.3色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為0.24%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 重復性

取阿膠強骨口服液(18101402)6份，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進樣，測定峰面積。結果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.47%，表明該方法重復性好。

2.1.5 穩定性

取阿膠強骨口服液(18101402)，按1.2.2方法制備供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.2.3色譜條件進樣，測定峰面積。結果顯示，毛蕊花糖苷峰面積的RSD為1.63%，表明供試溶液在12 h內穩定。

2.1.6 加標回收率

取已知含量的阿膠強骨口服液(18101402)6份，加入一定量的毛蕊花糖苷標準溶液，按1.2.2方法制備供試溶液，按1.2.3色譜條件進樣，測定峰面積，計算加標回收率。結果顯示，平均加標回收率為105.17%，RSD為1.11%。

2.2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測定方法學考察

2.2.1 高效液相色譜圖

取毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液及供試溶液按1.3.3色譜條件進樣，結果見圖2。

圖2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液(a)及供試溶液(b)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC spectra of calycosin-7-O-β-D-glucopyranoside standard solution(a) and test solution(b)

2.2.2 線性關系

分別取125.75 μg·mL-1、62.88 μg·mL-1、31.44 μg·mL-1、15.72 μg·mL-1、7.86 μg·mL-1、3.93 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液，按1.3.3色譜條件進樣，測定峰面積，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線，擬合得線性方程y=45232x+18634(R=0.9996)。表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度在3.93～125.75 μg·mL-1范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2.3 精密度

精密吸取50.3 μg·mL-1的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液，按1.3.3色譜條件連續進樣6次，測定峰面積。結果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為0.55%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性

取阿膠強骨口服液(18100501)6份，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進樣,測定峰面積。結果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.43%，表明該方法重復性好。

2.2.5 穩定性

取阿膠強骨口服液(18100501)，按1.3.2方法制備供試溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h按1.3.3色譜條件進樣，測定峰面積。結果顯示，毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD為1.92%，表明供試溶液在12 h內穩定。

2.2.6 加標回收率

取阿膠強骨口服液(18100501)6份，每份加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷標準溶液，按1.3.2方法制備供試溶液，按1.3.3色譜條件進樣測定，計算加標回收率。結果顯示，平均加標回收率為96.23%，RSD為2.9%。

2.3 正交實驗結果

取4 000支阿膠強骨口服液處方量的熟地黃、黨參、黃芪、枸杞、阿膠、牡蠣，置于連續逆流提取設備中提取，收集提取液，減壓回收乙醇，濃縮至一定比重的浸膏，其余步驟按原工藝進行配制口服液。正交實驗結果與分析見表3，方差分析見表4。

以綜合評分為考察指標，采用極差直觀分析4個因素對提取效果的影響大小依次為D>C>B>A；方差分析結果顯示，D因素有極顯著性差異，C因素有顯著性差異。結合直觀分析，確定連續逆流最佳提取工藝為A1B1C2D3，即料液比1∶6、乙醇體積分數40%、提取時間120 min、提取溫度80 ℃。

表 3 正交實驗結果與分析

Tab.3 Results and analysis of orthogonal experiments

表 4方差分析

Tab.4 Variance analysis

注：F0.05(2，2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00。

2.4 提取工藝驗證

稱取處方量的各個藥材，按最佳提取條件進行3次驗證實驗，測得毛蕊花糖苷含量分別為25.75 μg、22.24 μg、28.05 μg；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分別為87.9 μg、70.84 μg、92.21 μg；黃芪甲苷含量分別為111.34 μg、94.58μg、121.26 μg；總多糖含量分別為15.41 mg、13.35 mg、17.93 mg。表明該提取工藝穩定可靠。

2.5 討論

阿膠強骨口服液(國藥準字Z2000039)是由新疆華世丹藥業股份有限公司研發的治療原發性骨質疏松癥及小兒佝僂病的一款經典中藥制劑，其以獨特的作用機理和顯著的臨床療效廣受患者青睞。作者所在課題組擬對阿膠強骨口服液進行創新再評價研究。將從藥物生產工藝、藥材質量標準(雜皮膠源阿膠質量監控)等方面對阿膠強骨口服液進行再評價研究，以期對該口服液進行守正創新，獲得一款療效確切、質量可靠、技術工藝先進的新型阿膠強骨口服液。

根據新頒中醫藥法中藥再評價是作為打破傳統中藥品種多、小、散、亂、全格局的必要途徑。目前我國中藥品種9 000多種，批號近6萬個，生產廠家近4 000家，行業集中度低，低水平重復，產品缺少深入研發。改變這種格局需要設計嚴謹、實施嚴格、結果可信的上市后的藥物再評價研究，需要經得起考驗的再評價循證證據。相比于傳統的加熱回流提取方式，新型連續逆流提取顯著改善了阿膠強骨口服液提取效率及提取溶劑的回收率，提取工藝和質量標準的改善是我國中藥做強做大的主攻方向。

本研究新增4種質控指標作為阿膠強骨口服液新型連續逆流提取工藝的監控指標，不僅對產品的生產和藥效具有指導作用，還給我國已上市產品再評價給出了參考。

3 結論

以毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷、總多糖含量和提取率為考察指標，采用多指標綜合評分法結合正交實驗，優化阿膠強骨口服液連續逆流提取工藝。結果表明，4個因素對提取效果的影響大小依次為：提取溫度>提取時間>乙醇體積分數>料液比，確定最佳提取工藝為：料液比1∶6(g∶mL)、乙醇體積分數40%、提取時間120 min、提取溫度80 ℃。