鹽堿復合脅迫下2種長富2號蘋果砧穗組合的光合及生理特性

高立楊，賈旭梅，朱祖雷，趙 通，劉 兵，張 瑞，張夏燚，黃宗昌，王延秀

(甘肅農業大學園藝學院，甘肅蘭州730070)

蘋果(Malus domesticaBorkh.)是世界性果品［1］。西北黃土高原產區是我國蘋果的優勢產區，具有海拔高、光照充足、晝夜溫差大等特點，但該地區土壤多為石灰質，鹽漬化嚴重(pH 7.98～8.92)［2］)，已成為影響蘋果生長發育和果實產量品質的重要因素［3］。優良的砧木可有效改善樹體生長，提高果實品質，提高植株的抗逆性［4］。李小紅等［5］研究發現鹽堿復合脅迫對蘋果不同砧穗組合的抗鹽堿化和遺傳改良具有重要影響，砧木通過影響接穗葉片的葉綠素含量，進而提高植株的光合效率，增加樹體的抗性。因此，選擇抗性較強的砧木進行嫁接，可有效緩解鹽堿復合脅迫對接穗生長帶來的不利影響，對蘋果種植優勢具有重要意義。

鹽堿逆境對植物生理生化特性的影響已成為近年來國內外專家研究的熱點。鹽堿復合脅迫會對植物產生滲透、離子脅迫及改變液泡和細胞質的pH等危害［6］，同時脅迫能不同程度地減弱植物的同、異化功能，當鹽分濃度超過植物葉片耐鹽閾值時，植物常常發生萎蔫或枯死現象［7］。Yang 等［8］研究證實紫花苜蓿在鹽堿復合脅迫下，凈光合速率、氣孔導度等光合參數顯著下降;顏宏等［9］在羊草上證實了鹽堿復合脅迫下光合色素含量呈下降趨勢;金微微等［10］報道鹽堿復合脅迫下高丹草葉片的F0(初始熒光)、Fm(最大熒光)、qP(光化學猝滅系數)、Fv/Fm(最大光化學效率)逐漸下降，脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)在鹽堿復合脅迫下均有不同程度的上升。高劍［11］研究表明龍葵幼苗通過大量積累脯氨酸以及SOD、POD升高來緩解鹽堿復合脅迫帶來的傷害。近年來，對單鹽或單堿的研究較多，鹽堿復合脅迫較少，尤其是在西北黃土高原產區蘋果砧穗互作的研究鮮見報道。

垂絲海棠(Malus halliana Koehne)原產于甘肅河西走廊，性喜陽光，抗寒性強，在微酸或微堿性土壤中均可生長［12］。平邑甜茶(Malus hupehensis)是我國寶貴但又緊缺的蘋果砧木資源，與不同蘋果品種嫁接親和力好，易于繁殖，嫁接樹生長較旺，且群體內個體在形態特征上整齊一致［13］。‘長富2號’是國內生產中應用較多的蘋果品種，其果實品質在現有富士系中最優，具有肉質細、致密、多汁，酸甜適度等優點［14］。本試驗以垂絲海棠和平邑甜茶2種砧木為基砧，分別嫁接‘長富2號’，探討不同砧穗組合在鹽堿復合脅迫下葉綠素、抗氧化酶及光合熒光特性，比較不同砧穗組合的耐鹽堿復合脅迫能力，以期為西北鹽堿地區蘋果的種植提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及其處理

試驗于2017年5—8月在甘肅農業大學避雨棚(103°34＇E，36°10＇N)中進行，2015 年 4 月在甘肅靖遠播種，2016年5月嫁接，選取生長一致的垂絲海棠/長富2號(cs+fs)、平邑甜茶/長富2號(py+fs)2 a生苗各20株，移入盛裝基質(20%蛭石，20%珍珠巖，60%泥炭)、重量為0.65 kg的花盆(內徑25 cm，深38 cm)中，每盆1株，統一管理30 d。翌日進行脅迫處理，以Hoagland營養液澆灌為對照，表示為cs+fs(CK)和py+fs(CK);營養液+鹽堿復合脅迫(NaCl與 NaHCO3按摩爾比 1∶1混合，濃度 100 mmol·L-1)為處理，表示為cs+fs和py+fs。每個處理10株，為避免鹽激反應，處理濃度按50 mmol·L-1每天遞增，待全部處理達到設定濃度后，開始計算脅迫時間。每隔5 d，于17∶00～18∶00定期定時澆灌500 mL Hoagland營養液(保證每次澆灌水分不從盆底滲出)，并在花盆下放置塑料托盤，每次澆灌用營養液沖洗托盤澆入花盆，進一步防止鹽的流失，保證脅迫濃度的一致。

1.2 測定項目與測定方法

1.2.1 光合、熒光參數及葉綠素含量的測定 光合指標分別于0、20、40 d測定，采用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR，Linco ln，NE，USA)于晴天早上9 ∶00～11∶00，選取接穗向陽、成熟的葉片測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間 CO2(Ci)、氣孔導度(Gs)，重復6次。光合儀系統控制葉片溫度25℃，測定系統采用開放式氣路，自然光源，光合有效輻射為400～600μmol·m-2·s-1，葉室內空氣流量設定為500 mL·min-1，室內 CO2濃度為(385±10)μL·L-1。

熒光參數測定天數同光合指標，且葉片同屬同一節位葉片。用黑膜包裹，暗處理30 min后采用葉綠素熒光成像儀(IMAGING-PAM，Walz，Effeltrich，Germany)測定熒光參數，主要為初始熒光(F0)、最大熒光(Fm)、最大光能轉化率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(qP)、量子產額Y(NO)、非調節性能量耗散量子產量Y(NPQ)，并用Imaging WinGegE software軟件分析數據。

葉綠素含量從處理當天(0 d)開始，每隔10 d測定1次，每次測定重復6次。摘下葉片，剪掉葉脈并洗凈磨碎。稱取新鮮樣品0.2 g于玻璃試管中，加入10 ml 80%丙酮提取，暗處理24 h，在波長645 nm和663 nm下測定吸光度，應用公式計算葉綠素a(Chl a)、葉綠素 b(Chl b)含量［15］。

1.2.2 生理指標測定 分別脅迫0、10、20、30、40 d后，取植株中上部功能性葉片，剪掉葉脈并洗凈磨碎，用于測定生理指標。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法［16］，SOD酶活性的測定采用氮藍四唑光化還原法［16］，POD 酶活性的測定采用愈創木酚法［17］。

1.3 數據分析

用Microsoft Office Excel 2013及Origin 2017進行數據處理及作圖，采用SPSS 22.0單因素ANOVA的LSD比較差異的顯著水平(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉片光合色素含量的影響

由圖1可得，隨脅迫時間的延長，cs+fs的葉綠素a含量呈先降后升的趨勢，葉綠素b含量和葉綠素a+b含量呈降-升-降的趨勢，葉綠素a/b呈降-升-降-升趨勢。脅迫至20 d時，葉綠素b含量和葉綠素a+b含量達最低值。脅迫至30 d時，葉綠素a含量和葉綠素a/b達最低值。脅迫至40 d時，葉綠素b含量和葉綠素a+b含量相比對照分別下降了3.72%和5.86%，但無顯著差異;葉綠素a含量和葉綠素a/b顯著低于對照(P＜0.05)，相比于對照分別降低了14.07%和12.95%。

而py+fs的葉綠素a含量和葉綠素a+b含量呈逐漸降低趨勢，葉綠素b含量呈先降后升趨勢，葉綠素a/b呈升-降-升-降趨勢。脅迫至30 d時，葉綠素b含量達最低值;脅迫至40 d時，葉綠素a含量、葉綠素a+b含量和葉綠素a/b達最低值，且葉綠素a含量、葉綠素b含量、葉綠素a+b和葉綠素a/b均顯著低于對照(P＜0.05)，相比于對照分別降低了40.15%、41.29%、32.61%和15.36%。

2.2 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉片光合特性的影響

圖2表明，鹽堿復合脅迫下，整個脅迫過程中，cs+fs的Pn、Gs、Tr均高于 py+fs，cs+fs 的Ci低于 py+fs。隨著脅迫時間延長，cs+fs 的Pn、Gs、Tr均呈降低趨勢，Ci呈上升趨勢。脅迫至20 d，cs+fs的Pn與對照并無顯著差異，Gs、Tr均顯著低于對照(P＜0.05)，Ci顯著高于對照(P＜0.05)。脅迫至 40 d，cs+fs的Pn、Gs、Tr均顯著低于對照(P＜0.05)，比對照分別降低了8.31%、51.20%、28.20%;Ci則顯著高于對照(P＜0.05)，比對照上升了34.05%。

圖1 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of saline-alkali stress on chlorophyll content of different scion-rootstock combinations

由圖2可得，隨著脅迫時間延長，py+fs的Pn、Gs、Tr均呈降低趨勢，Ci呈上升趨勢。脅迫至 20 d，py+fs 的Pn、Gs、Tr均顯著低于對照(P＜0.05)，Ci顯著高于對照(P＜0.05)。脅迫至40 d，cs+fs的Pn、Gs、Tr均顯著低于對照(P＜0.05)，相比對照分別降低了45.88%、52.20%、44.82%;Ci則顯著高于對照(P＜0.05)，相比對照上升了59.95%。

2.3 鹽堿復合脅迫對不同砧穂組合葉片熒光參數的影響

鹽堿復合脅迫下，整個脅迫過程中，cs+fs的Fm、Fv/Fm、qP均高于 py+fs，F0、Y(NO)則低于 py+fs(圖3)。隨脅迫時間的延長，cs+fs的F0、Fm、Fv/Fm、qP均呈降低趨勢，Y(NO)、Y(NPQ)呈上升趨勢。脅迫至 20 d，與對照相比，F0、Fm、Fv/Fm、qP均出現下降，Y(NO)出現上升，其中F0、Fv/Fm均顯著低于對照(P＜0.05)，Y(NO)、Y(NPQ)顯著高于對照(P＜0.05)，qP、Fm與對照相比無顯著差異(P＜0.05)。脅迫至40 d，F0、Fm、Fv/Fm、qP進一步下降，均顯著低于對照(P＜0.05)，相比于對照分別下降25.45%、9.52%、2.59%和 5.45%;Y(NO)、Y(NPQ)則進一步升高，均顯著高于對照(P＜0.05)，分別上升24.24%和72.06%。

由圖3可得，隨著脅迫時間的延長，py+fs的F0、Fm、Fv/Fm、qP、Y(NPQ)均呈降低趨勢，Y(NO)呈上升趨勢。脅迫至 20 d，與對照相比，F0、Fm、Fv/Fm、qP、Y(NPQ)均出現下降，顯著低于對照(P＜0.05)，Y(NO)出現上升，顯著高于對照(P＜0.05)。脅迫至40 d，F0、Fm、Fv/Fm、qP、Y(NPQ)進一步下降，均顯著低于對照(P＜0.05)，相比于對照分別下降了33.33%、21.05%、3.38%、31.67%和76.47%;Y(NO)進一步上升，顯著高于對照(P＜0.05)，相比對照上升了51.35%。

2.4 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉片游離脯氨酸含量的影響

由圖4可知，隨著脅迫時間的延長，cs+fs的游離脯氨酸含量均呈先升后降的趨勢。脅迫至20 d，cs+fs游離脯氨酸含量顯著高于對照(P＜0.05)，相比對照升高34.62%，且達到峰值。脅迫至40 d，cs+fs組合游離脯氨酸含量出現下降，且顯著低于對照，相比對照降低了9.35%(P＜0.05)。隨著脅迫時間的延長，py+fs的游離脯氨酸含量均呈先升后降的趨勢。脅迫至10 d，py+fs游離脯氨酸含量顯著高于對照(P＜0.05)，相比對照升高24.95%，且達到峰值。脅迫至40 d，py+fs的游離脯氨酸含量顯著高于對照(P＜0.05)，相比對照升高17.13%。

2.5 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉片抗氧化酶活性的影響

圖2 鹽堿復合脅迫對不同砧穂組合光合特性的影響Fig.2 Effects of saline-alkali stress on photosynthetic parameters of different scion-rootstock combinations

圖3 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合葉綠體熒光參數的影響Fig.3 Effects of saline-alkali stress on chloroplast flourescence parameters of different scion-rootstock combinations

圖4 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合游離脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of saline-alkali stress on free proline content of different scion-rootstock combinations

隨著脅迫時間的延長，2種砧穗組合的SOD和POD活性均呈先升后降的趨勢(圖5)。cs+fs的SOD、POD活性均在脅迫30 d時達到峰值，分別比對照高42.66%和10.62%;脅迫至40 d時，cs+fs的SOD、POD活性出現下降，仍顯著高于對照(P＜0.05)，分別比對照高34.11%、5.03%。py+fs的SOD、POD活性均在20 d時達到峰值，分別比對照高35.36%和10.90%。脅迫至40 d時，py+fs的SOD、POD活性出現下降，仍顯著高于對照(P＜0.05)，分別比對照高6.02%、3.64%。

3 討 論

3.1 鹽堿復合脅迫對不同砧穂組合光合熒光特性的影響

圖5 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合SOD、POD活性的影響Fig.5 Effects of saline-alkali stress on SOD and POD activity of different scion-rootstock combinations

葉綠素是植物光合作用的主要色素，其含量高低在一定程度上可衡量植株的耐鹽性［15］。王偉華等［18］研究發現，鹽堿復合脅迫引起的高pH，破壞了離子穩態，使與葉綠素合成有關離子如Fe2+、Mg2+、Cu2+等沉淀，進而打破了葉綠素合成與分解的動態平衡，導致葉綠素含量降低。本試驗中，脅迫初期，2種砧穗組合的葉綠素含量均逐漸降低，說明此時2種砧穗組合均未適應脅迫，可能是脅迫抑制了根系對相關離子的吸收，從而導致葉綠素合成受阻。這與厲書豪等［19］在黃瓜上的研究結果一致。隨著脅迫時間的延長，2種砧穗組合的葉綠素b含量出現最低值的時間點均早于葉綠素a，說明葉綠素b對鹽堿復合脅迫的敏感性高于葉綠素a。2種砧穗組合中，cs+fs葉綠素a含量在脅迫后30 d達到最低值，40 d時又出現上升，而py+fs的葉綠素a含量呈降低趨勢，說明40 d時cs+fs已經適應了鹽堿復合脅迫，而py+fs尚未適應。因此，認為cs+fs的耐鹽堿能力強于py+fs。吳玉霞等［20］發現平邑甜茶相較于其他砧木耐性較差，而石曉昀［21］和胡亞［22］證明垂絲海棠是一種耐性較強的砧木。這些結果為垂絲海棠是一種耐鹽堿的蘋果砧木提供了依據。此外，整個脅迫過程中cs+fs的葉綠素含量均高于py+fs，說明cs+fs有較強的光能利用率，進一步說明cs+fs的耐鹽堿性強于py+fs。

光合作用可作為判斷植物長勢和抗逆性強弱的重要指標［21］。大量的研究表明，鹽堿復合脅迫下影響光合作用的因素包括氣孔和非氣孔因素，當Ci和Gs同時降低時，光合速率降低是由氣孔因素引起的，反之Pn、Gs、Tr均呈逐漸降低趨勢，Ci呈上升趨勢，說明此時葉肉細胞對CO2利用率較低，光合速率的下降主要由非氣孔因素引起的［23］。有研究表明非氣孔因素對光合的影響途徑除了葉綠素含量的下降還包括葉綠體結構破壞、光合酶活性降低、活性氧代謝功能破壞等［24］。本試驗中，2種砧穗組合的光合作用均受到了抑制，可能是鹽堿復合脅迫誘導的滲透脅迫、離子毒害和高pH損害PSⅡ氧化側的放氧復合物的功能，使它向PSⅡ反應中心提供的電子數量減少;而金微微等［10］認為脅迫阻斷PSⅡ還原側從QA向QB的電子傳遞，進而導致葉綠體對光能的吸收利用率降低，使光合速率下降。整個脅迫過程中，cs+fs的Pn、Gs、Tr均顯著高于 py+fs，Ci顯著低于 py+fs，且 cs+fs的Pn、Gs、Tr的降幅均小于 py+fs，Ci上升幅度小于py+fs，說明鹽堿復合脅迫對cs+fs的影響小于py+fs。

葉綠素熒光是光合作用的探針，可以反映脅迫對光合的內在影響［25］。本試驗中，隨著脅迫時間延長，2 種砧穗組合F0、Fm、Fv/Fm、qP均逐漸降低，且在脅迫40 d后顯著低于對照。F0是PSⅡ反應中心處于完全開放時的熒光產量，其變化程度可推測植物的光保護機制和PSⅡ反應中心的狀況［26］，唐秀梅等和云菲等［27-28］認為，F0的降低主要是 PSⅡ天線色素的熱耗散引起，F0的變化與葉綠素含量密切相關，會隨葉綠素含量的降低而降低，說明鹽堿復合脅迫下2種砧穗組合F0的降低可能是由葉綠素含量的降低引起的。Fm是PSⅡ反應中心完全關閉時熒光的產量，可反映PSⅡ電子傳遞情況［29］，鹽堿復合脅迫下Fm降低說明2種砧穗組合的PSⅡ電子傳遞均受到了抑制。這與呂星光等［30］在甜瓜上的研究結果一致。Fv/Fm反映暗適應條件下PSⅡ的最大光化學效率［31］，鹽堿復合脅迫下，Fv/Fm降低表明葉片發生了明顯的光抑制，Lavinsky等［32］在格尼帕果幼苗上也證明了此觀點。qP是光化學猝滅系數，表示植物所吸收的光能被用于光化學電子傳遞的量，可在一定程度上反映植物光合能力的強弱［28］，鹽堿復合脅迫下，qP降低說明植物光合能力受到了明顯削弱，這與 Mohammed Mouradi等［33］在紫花苜蓿上的研究結果一致。Y(NPQ)反映光系統II耗散過剩光能進行自我保護下的調節作用，鹽堿復合脅迫下，Y(NPQ)升高，說明植物通過熱耗散來進行自我保護。Y(NO)是植物非調節性能量耗散的量子產額，參數Y(NO)過大，一方面表明光化學能量轉換和自我保護調節機制比較脆弱，另一方面表明植物已經無法耗散過多的光能，由此可判斷植物受到傷害的程度［34］。本試驗中，2 種組合F0、Fm、Fv/Fm、qP均逐漸降低，說明鹽堿復合脅迫下，2種組合的光合電子傳遞均受到抑制，進而不同程度削弱了其光合能力，且多余的光能觸發了這2種組合的光保護機制［35］，cs+fs的下降幅度小于 py+fs，說明鹽堿復合脅迫對py+fs的傷害更嚴重，這與王延秀等［36］的研究結果一致。此外，鹽堿復合脅迫下，cs+fs的Y(NPQ)呈上升趨勢，而py+fs的Y(NPQ)呈下降趨勢，整個脅迫過程中py+fs的Y(NO)顯著高于cs+fs，說明cs+fs的光保護機制較強，是通過熱耗散來實現光保護，而py+fs的光保護機制較為脆弱，在脅迫初期熱耗散系統就受到了嚴重傷害，這進一步說明鹽堿復合脅迫對py+fs的傷害更嚴重。

3.2 鹽堿復合脅迫對不同砧穗組合生理特性的影響

鹽堿復合脅迫下，由于植物光合作用被抑制，過剩的光能會對植物的膜系統造成破壞，產生大量的活性氧、自由基，形成滲透脅迫和氧化脅迫，對植物正常生長造成嚴重傷害［37］。脯氨酸是植物體內主要的滲透調節物質，植物受到逆境脅迫時滲透勢會降低，植物通過積累體內脯氨酸來調節滲透勢，降低植物傷害［38］。本試驗中，2種砧穗組合游離脯氨酸含量均呈先升后降的趨勢，說明植物通過積累游離脯氨酸來抵抗鹽堿復合脅迫。cs+fs和py+fs的游離脯氨酸含量分別在30 d和20 d達到峰值，表明達到了2種組合對鹽堿復合脅迫的最大耐受性，超過植株最大耐受性后，2種組合的滲透調節系統被破壞，植株體內脯氨酸含量開始降低，這與左鳳月［39］在白刺上的研究結果一致。整個脅迫過程中，cs+fs的游離脯氨酸含量顯著高于py+fs，且cs+fs的峰值出現晚于py+fs，說明cs+fs最大耐受性高于py+fs，可能是由于砧木耐性差異造成。此外，谷艷芳等［40］在小麥上的研究也表明鹽脅迫下游離脯氨酸含量會呈現出上升趨勢，與本文研究相一致。

SOD、POD能夠清除生物體內超氧陰離子自由基，保護機體免受自由基的傷害［41］。本試驗中，2種砧穗組合的SOD、POD活性均呈先升后降的趨勢，在脅迫初期，2種組合的抗氧化酶活性均上升，說明抗氧化酶系統啟動開始緩解脅迫，而后cs+fs的2種酶活性在30 d時達到峰值，py+fs則在20 d達到峰值，說明已經達到了植物最大耐受性，當脅迫突破臨界值時又開始下降，這與米永偉等［42］在菘藍幼苗上的研究結果一致，即在鹽脅迫下，菘藍幼苗SOD、POD活性均呈現先升后降的趨勢。在鹽堿復合脅迫下，植物通過抗氧化酶系統的啟動清除活性氧，緩解植物在脅迫下所受的滲透傷害［43］，當脅迫超過植株最大耐受性，抗氧化酶系統完全被破壞的時SOD、POD活性出現下降。整個脅迫過程中，cs+fs的SOD、POD活性顯著高于py+fs，且cs+fs的峰值出現晚于py+fs，說明cs+fs最大耐受性高于py+fs。

綜上，鹽堿復合脅迫下，cs+fs與py+fs 2種砧穗組合均通過降低Pn、Gs、Tr;大量積累滲透調節物質以及啟動抗氧化系統來維持光合系統傷害與修復的動態平衡。且cs+fs在復合鹽堿脅迫下的表現優于py+fs。