松嫩草原鹽堿土細菌多樣性分析

向君亮，劉 權，申永瑞，王佳琦，張興梅，王 鵬，殷奎德

(1.黑龍江八一農墾大學農學院，黑龍江大慶163319;2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，黑龍江大慶163319)

土壤鹽堿化是全球面臨的主要環境問題之一。

據統計，世界上有約1/3的土地受到鹽堿化影響，中國有367萬 hm2鹽堿地［1］，其主要分布于東北平原、華北平原、西北沙漠及沿海地區［2］。松嫩平原地處干旱-半干旱地區，是世界三大蘇打型鹽漬區之一，其受鹽害土壤超過30萬hm2。松嫩鹽堿地不同于其他地方的特點是，其土壤中含大量的碳酸鈉和碳酸氫鈉，同時伴隨著高pH值、高鈉吸收率及表層土高度堿化［3］。由于受到化學性質的影響，土壤的物理性質變得很差，例如土壤粘度大，透氣、透水性差等［4］。隨著世界人口的日益增加和城市化進程的推進，耕地面積逐年減少，在這樣的雙重壓力下，有效開發利用鹽堿地資源，是維持農業的可持續發展，進一步挖掘鹽堿化地區農業發展潛力的一條重要出路。

相比于磷脂脂肪酸法和PCR-DGGE法，高通量測序技術具有更多的優點，其測序深度高，可以檢測到那些不可培養的微生物群落，能更加真實地揭示原位環境中微生物群落組成，因此，在研究環境微生物多樣性中應用越來越廣泛。Zhou等［8］利用高通量測序法研究了不同退化程度下青藏高原高寒草原土壤微生物群落的變化，結果發現青藏高原退化草原土壤中細菌群落以放線菌門為主，其次是變形菌門;牛世全等［9］發現，河西走廊鹽堿土壤中變形菌門占主導地位，其余主要的細菌群落依次是放線菌門、擬桿菌門、酸桿菌門等9個菌門。本研究采用高通量測序技術對3種不同程度鹽堿草原土壤細菌群落結構進行分析，旨在揭示不同鹽度和堿度協同作用下的草原土壤微生物群落結構，對了解松嫩草原蘇打鹽堿土壤細菌群落結構的多樣性及開發利用極端環境微生物資源具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣點位于黑龍江省大慶市一處未經人為破壞的鹽堿草原(46°36＇23″N，125°10＇44″E)。根據植被密度和地面白色堿斑的程度，將其劃分為3種類型:地表無白色堿斑，且植被生長茂盛的地塊為輕度鹽堿化土(SS);地表有少量白色堿斑，且有稀疏植被生長的地塊為中度鹽堿化土(MS);地表有大量白色堿斑，且無植被覆蓋的地塊為重度鹽堿化土(HS)。2017年9月12日采樣，每個類型土壤隨機選取5個點，用鐵鍬采取地面0～20 cm土層深處土樣，挑出枯草、草根及石塊，混勻，裝在無菌塑料袋中，置于干冰中運回實驗室。將土壤分為兩份，一份風干后用于土壤理化性質的測定，另一份于-80℃儲存用于土壤微生物多樣性測定。

1.2 植被覆蓋密度統計

在草原上分別選取地表無白色堿斑，且植被覆蓋度良好的地塊以及地表有少量白色堿斑，且有稀疏植被覆蓋的地塊各5塊，每塊面積取0.5 m×0.5 m，統計樣方內植被植株數量，求得平均值后換算為每平方米內植株數量。

1.3 土壤性質測定

土壤pH值、堿解氮、有效磷、速效鉀、有機質、堿化度、可溶性鹽含量測定參照呂貽忠等［10］、姜海燕［11］方法進行，并稍加改進。

1.4 DNA提取與PCR擴增

采回的土樣按照土壤基因組DNA提取試劑盒操作說明提取土壤細菌基因組總DNA，用NanoDrop 2000紫外微量分光光度計及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的質量與完整性;利用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGG)和907R(CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)擴增土壤細菌的16SrDNA的V4-V5區，擴增完成后以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，利用DNA純化試劑盒對PCR產物進行純化。

1.5 測序與分析

純化后的PCR產物由深圳華大基因股份有限公司進行高通量測序。測序完成后，在生物信息學分析之前對原始數據進行處理，通過去除被適配器、模糊堿基污染的序列以便獲得更準確和可靠的結果。使用FLASH和Trimmomatic軟件對序列進行優化，方法和參數如下:(1)過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置25 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后25 bp以下的reads，去除含N堿基的reads;(2)根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接成一條序列，最小overlap長度為10 bp;(3)拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列;(4)根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2;經過優化后的數據利用QIIME進行質控過濾以及OTU聚類，聚類相似度為0.97，聚類完成后在Silva數據庫中進行比對，對各個樣本的OTU在各分類等級上的群落組成進行注釋。

2 結果與分析

2.1 植被覆蓋密度調查

鹽堿地面植物的覆蓋與生長狀況可以直接反映出土壤環境的好壞。通過對0.5 m×0.5 m樣方內的植株數量進行統計，經換算后結果如圖1所示。3種鹽堿地的植被覆蓋密度明顯不同，輕度鹽堿土地塊(SS)植株數量最多，覆蓋密度最大，為2 985株·m-2，中度鹽堿土地塊(MS)覆蓋密度為880株·m-2，重度鹽堿土塊(HS)無植被生長。植被覆蓋度的差異可能是由于土壤的pH值、含鹽量及養分等因素造成的。

2.2 土壤理化性質分析

對土壤的理化性質及肥力指標進行了測定，結果如表1所示。土樣SS的pH值為8.24，MS的pH值為9.52，HS的pH值為10.20，3種土樣的pH值均大于8，是典型的堿土。隨土壤鹽堿化加重pH值逐漸增大，這可能與其含鹽種類、含鹽量及堿化度有關，也有可能是輕度鹽堿土和中度鹽堿土上有植物長期生長，植物根系分泌的有機酸及植物殘體的分解降低了土壤的pH值。3個類型的土壤中，中度鹽堿土的鹽含量最高，達到1.43%，輕度鹽堿土含鹽量最低為0.30%。在堿化度上，隨著鹽堿程度的加重，堿化度也隨之增加，重度鹽堿土的堿化度最大，為84.59%，輕度鹽堿土的堿化度為23.28%，堿化度均大于20%，為堿土。3種土樣無論是在可溶性鹽總量還是堿化度指標上均具有顯著差異。在肥力指標方面，隨著鹽堿程度的提高，堿解氮、速效鉀、有效磷和有機質的含量降低，輕度鹽堿土的堿解氮、速效鉀、有效磷和有機質含量最高，分別為303 mg·kg-1、402 mg·kg-1、20.3 mg·kg-1、32.70 g·kg-1，重度鹽堿土各項肥力指標均為最低。

2.3 土壤微生物群落高通量測序分析

經過測序分析，3組土壤樣品的稀釋曲線如圖2(a)所示，稀釋曲線趨于平緩，說明測序趨于飽和，所取序列數能較為真實地反映出樣本中的細菌群落。同時物種覆蓋指數表明，測序數據能包含樣品中99%以上的物種，能較好地反映出樣品中的細菌群落組成，但仍然有少量細菌可能未被發現。

如圖2(b)所示，3組樣本共得到2841個OTU，其中 SS、MS和 HS組各有1462、1423、1030個 OTU;SS組中特有的OTU為914個，MS組中特有的OTU為565個，HS組中特有的OTU為476個。通過對各樣本中的OTU數目進行分析后發現，3種不同鹽堿程度的鹽堿土OTU數目SS＞MS＞HS，說明輕度鹽堿土的細菌類群最為豐富，重度鹽堿土中細菌類群最少;SS組與HS組共有OTU僅為216個，說明這兩組土壤的細菌類群一致性最低，差異較為明顯。從整體來看，3種鹽堿土各自特有的OTU數目占總OTU數的比例較大，雖然有一部分一致的細菌群落，但是三者之間的細菌群落差異還是較為明顯，PCA分析也得到了一致的結果(圖3)。

圖1 不同鹽堿地植被密度統計Fig.1 Vegetation coverage density in different saline-alkali land

表1 松嫩平原不同鹽堿化土壤理化性質Table 1 Statistics of soil physical and chemical properties of Songnen Plain

圖2 鹽堿土壤樣品稀釋曲線與OTU數量韋恩圖Fig.2 Rarefaction curve and Venn diagram of OTU number in saline-alkali soil samples

2.4 細菌群落結構分析

通過對3組鹽堿土樣細菌16SrDNA V4-V5區進行測序、比對后發現，共有39個菌門被檢測出來(圖4a)，其中SS組中檢測到32個菌門，MS組檢測到34個菌門，HS組中檢測到31個菌門。酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、泉古菌門(Crenarchaeota)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)以及硝化螺旋菌門(Nitrospirae)為3種鹽堿土壤中最主要的菌門。WS3、GAL15、GN04、LD1、NC10 為 SS 組特有菌門，Kazan-3B-28、WPS-2為MS組特有菌門。隨著鹽堿化程度的增加，泉古菌門的相對豐度從10.48%減少到1.25%，酸桿菌門的相對豐度也急劇下降，從SS組中的32.28%下降到MS組中的9.64%，但在MS與HS組中相對豐度差異不大。然而放線菌門和浮霉菌門的相對豐度卻從7.74%、4.63%增加到22.57%、8.28%。擬桿菌門和芽單胞菌門的相對豐度也有增加的趨勢，分別從4.11%、4.10%增加到10.64%、18.80%，但是二者在MS和HS中的相對豐度差異不大。另外，變形菌門和綠彎菌門的相對豐度在MS組中最高，在HS和SS組中差異不大。

圖3 樣本主成分分析Fig.3 PCA of soil samples

在屬分類水平上，除去未命名的菌屬，共有12個菌屬被鑒定出來，其中SS組7個，MS組11個，HS組11個，KSA1為HS組中特有菌屬。熱圖分析表明(圖4b)，SS和MS的微生物類群相似度較高，聚為一類。鹽單胞菌屬(Halomonas)、浮霉菌屬(Planctomyces)、Rubricoccus的相對豐度與鹽堿土的鹽堿程度呈正相關，Candidatus_Entotheonella、Candidatus_Nitrososphaera的相對豐度與鹽堿土的鹽堿程度呈負相關，而土壤桿菌屬(Agrobacterium)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、Euzebya、Pontibacter、Rubrobacter主要在MS組中聚集。SS組與MS組中相對豐度最大的菌屬均為Candidatus_Nitrososphaera(10.43%、2.18%)，此外，Rubrobacter(1.29%)、Euzebya(1.51%)均為MS組中優勢菌屬;在HS組中相對豐度最大的菌屬為KSA1(3.18%)，其他優勢菌屬還有Candidatus_Nitrososphaera(1.25%)、浮霉菌屬(Planctomyces)(1.08%)以及鹽單胞菌屬(Halomonas)(1.37%)。

2.5 環境因子與菌群關聯分析

RDA分析可以得到環境因子與樣本分布和菌群結構之間的關系。本研究通過Canoco 4.5 For Windows軟件對土壤理化因子對菌群結構的影響進行分析，理化因子包括可溶性鹽(Soluble salt)、pH值、堿化度(ESP)、堿解氮(AN)、有效磷(AP)、速效鉀(AK)和有機質(OM)含量，這些環境因子與細菌群落結構有著密不可分的關系。如圖5所示，堿化度、可溶性鹽含量、pH值與土壤的肥力因子(堿解氮、有效磷、速效鉀和有機質含量)呈負相關，從環境因子與樣本之間的關系來看，輕度鹽堿土與土壤肥力因子呈正相關，與pH值、堿化度和可溶性鹽含量呈負相關，而中度和重度鹽堿土則與輕度鹽堿土相反。環境因子與菌群結構的關系如圖5(a)所示，這些細菌門類幾乎被分成了4組，第Ⅰ組包括放線菌門、浮霉菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、厚壁菌門在內的5個菌門占整個群落相對豐度的44.31%，它們的相對豐度與土壤pH值、堿化度呈正相關;第Ⅱ組包括酸桿菌門、泉古菌門、硝化螺旋菌門、廣古菌門、TM7在內的5個菌門的相對豐度占總豐度的25.19%，它們的相對豐度與堿解氮、有機質以及速效鉀含量呈正相關;而第Ⅲ組僅有疣微菌門和綠彎菌門，它們的相對豐度分別與有效磷含量和可溶性鹽含量呈正相關。

環境因子與菌屬的關系如圖5(b)所示，這些細菌屬被分成了3組，第Ⅰ組包括4個菌屬，即鹽單胞菌屬、KSA1、浮霉菌屬、Rubricoccus，其豐度與土壤的堿化度和pH值呈正相關;第Ⅱ組包括6個菌屬，分別為土壤桿菌屬、纖維弧菌屬、尤澤比氏菌屬、Gemmata、Pontibacter、紅色桿菌屬，其豐度與土壤的可溶性鹽含量呈正相關;第Ⅲ組僅有 2個菌屬，Candidatus Entotheonella和氨氧化菌屬，其豐度與土壤有機質、堿解氮、速效鉀等肥力指標呈正相關。

圖4 不同鹽堿土壤樣品中細菌組成Fig.4 Relative abundances of bacteria in different saline-alkali soil samples

圖5 土壤樣品細菌群落與土壤理化因子相關性冗余分析Fig.5 Redundancy analysis biplot between the microbial communities and soil properties

3 討論

鹽堿土在我國分布較為廣泛，但鹽堿類型有所不同。東部沿海地區為氯化物鹽土，華北和河套平原主要以氯化物與硫酸鹽混合類型的鹽堿土為主，然而東北松嫩平原、山西大同盆地的鹽堿土主要以碳酸鹽、重碳酸鹽為主，因此也稱蘇打鹽土［12］。本研究所采集的3種鹽堿土pH值分別為8.24、9.52、10.20。王爽［13］在研究大慶地區重度鹽堿土土壤性質時發現，土壤的pH值為10.52，含鹽量為1.14%，堿化度為75.76%，與本研究所得結果相似。由于蘇打型鹽堿地有大量碳酸根和重碳酸根作用，即使土壤含鹽量較低，其pH值也普遍較高。植物要在這樣的環境下生存，不僅要避免因吸收過多Na+造成的鈉離子毒害，還要耐受較高pH值所帶來的堿脅迫作用。這種環境會導致植物根系腐爛，大部分植物難以生存。因此，3種鹽堿地上植被密度也隨著鹽堿程度的加重而減少。

有機質、堿解氮、有效磷、速效鉀是土壤肥力的重要指標。土壤酸堿性則是影響土壤肥力的一個重要因素。它不僅直接影響植物的生長發育，還影響著土壤對有機質的分解，營養元素的釋放與轉化，土壤離子的交換、運動、遷移和轉化等［11］。鹽堿土中由于含有大量鹽分且pH值較高，所以土壤肥力較低。松嫩草原是我國典型的鹽堿草甸草原，其土壤類型為黑土。黑土的有機質含量高，肥力較好，但隨著鹽堿程度的增加，動植物越來越難以存活，腐殖質的補給量急劇減少，由此造成土壤退化。本研究所采集的3種鹽堿土中，SS組的鹽堿土由于植被生長旺盛，植物殘體補充了土壤中的腐殖質，然而隨著鹽堿化程度的增加，植被覆蓋度越來越小，土壤中腐殖質的來源也急劇減少，因而有機質含量隨之降低。

前人研究發現，土壤鹽漬化程度越低，土壤細菌群落的多樣性和豐富度越高［14］，本研究得出結果與其一致。隨著鹽堿濃度的增加，細菌群落結構差異顯著，細菌豐度降低。導致土壤中細菌群落結構不同的因素有很多，例如土壤的理化性質對細菌和植物具有一定的篩選作用，其主要表現為高鹽度對細胞的損害［15］。因此，隨著土壤鹽分的增加，只有耐鹽性強的細菌或植物才能存活。動植物的殘體以及植物的根分泌物等可以為土壤中細菌生存提供所需的營養物質。以往的研究表明，植物根系分泌物會引起根際土壤微生物群落的變化［16］。在本研究中，隨著鹽堿化程度的加重，土壤理化性質(養分、可溶性鹽含量、pH、堿化度、酶活性等)與地上植被特征存在顯著差異。沒有植物可以在HS組的土壤中生存，土壤中缺乏植物殘留物，可供細菌利用的營養物質較SS和MS組少，因此其豐度較低。由于營養物質的匱乏，一些需要豐富營養的細菌豐度低于SS組，如β-變形菌綱的細菌，這些差異導致了微生物群落結構和組成上的差異。本研究結果表明，隨著土壤鹽漬化程度的加重，土壤性質對微生物種群的影響越來越大，而在這種極端環境下能夠存活的植物越來越少，可供微生物利用的有機物和根系分泌物等營養成分越來越少，因而細菌群落的結構發生了改變。

松嫩鹽堿草地細菌群落以放線菌和變形細菌為主，這一結果與前人類似研究中的發現是一致的。放線菌由于其特殊的形態和細胞結構，能產生菌絲和孢子，抵抗外界的惡劣環境，因此廣泛分布于各種生態環境中，特別是在極端環境中。MS組與HS組中放線菌的相對豐度明顯高于SS組，說明放線菌能更好地適應極端環境。Tian等［17］研究發現，濱海鹽堿土中最主要的細菌群落為放線菌門和變形菌門;Goordial等［18］應用宏基因組測序和活性測定研究大河流域多年凍土和新石器時代群落的功能容量，結果發現，這種極端環境下放線菌是最主要的菌門。Yergeau等［19］通過亞基因組測序、qPCR和微陣列分析發現，活性層土壤和永久凍土微生物群落結構非常相似，其中以放線菌為主。Zhou等［8］研究發現青藏高原退化草原土壤中細菌群落以放線菌門為主，其次是變形菌門。在本研究中，其他較為豐富的菌門還有酸桿菌門，綠彎菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門和厚壁菌門等，這些細菌在草地生態系統中具有重要的作用，例如降解動植物尸體，參與碳循環、能量循環過程。隨著鹽堿程度的增加，土壤中可供微生物利用的營養物質越來越少。Kuzenstol等［20］發現，多數γ變形菌綱的細菌為貧養菌，寡營養細菌有從大氣中攝取營養物質的能力，可利用大氣中的微量碳、氮源來維持正常的生長［21］。我們發現，芽單胞菌門、浮霉菌門及γ變形菌綱的相對豐度與土壤鹽堿化程度成正比，然而一些富養菌的相對豐度(如β-變形菌綱)卻隨著土壤鹽堿程度的降低而減少，這與Wang等［22］描述的相一致。

本研究發現，鹽單胞菌屬、KSA1、浮霉菌屬、Rubricoccus的豐度與土壤的pH值和堿化度呈正相關。前人研究發現，鹽單胞菌屬細菌可以在細胞內積累高濃度陽離子以維持細胞內部的滲透平衡，還可以通過反向轉運鈉離子/鉀離子，將細胞內過多的鈉離子排至細胞外，同時增加鉀離子和其他營養物的吸收維持細胞滲透壓。孟琳［23］研究發現，肇東鹽單胞菌(Halomonas zhaodongensis)NEAU-ST 10-25中存在的Na+/H+逆向轉運蛋白基因可以明顯增加大腸桿菌的耐鹽能力。有研究表明，鹽單胞菌屬、Rubricoccus均為耐鹽堿細菌［24］，而大多數耐鹽堿細菌需要一定的鹽濃度來維持細胞形態;因此，鹽單胞菌屬、Rubricoccus的豐度與土壤鹽堿化程度呈正相關。

土壤微生物群落結構受到諸多因素的影響，除土壤理化因子外，溫度、降水量、植被種類等均會影響其結構組成。由于黑龍江省冬季氣候嚴寒，夏季炎熱，年溫差可達60℃，因此，在時間維度上與土壤細菌群落結構多樣性的關系還有待于進一步研究。