響應面法優化桂北金槐槐米固態發酵工藝條件

李琦玲　李豫　王志偉　顧生玖　朱開梅

摘要：以桂北金槐（Sophora japonica cv.jinhuai）為原材料進行青霉菌（Penicillium）固態發酵，優選出桂北金槐槐米固態發酵的最佳工藝。以槲皮素含量為因變量，采用單因素試驗和響應面法優化試驗優化發酵條件。結果表明，根據所建模型得到發酵金槐槐米的最佳工藝為溫度29.97 ℃、時間6.88 d、轉速180.86 r/min，接種量3.93 mL，槲皮素預計含量為34.81 mg/g，在此基礎上調整發酵參數，實際含量為33.67 mg/g，與預測值相近。證明響應面法優化槐米發酵工藝合理，為該藥材的開發和利用提供參考。

關鍵詞：金槐;槐米;槲皮素;青霉菌;發酵工藝;響應面法

中圖分類號： S188+.4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0230-06

豆科植物槐（Sophora japonica L.）的干燥花蕾習稱槐米（flos sophorae immaturus），其形狀如米粒，主要含有蕓香苷和槲皮素等10余種黃酮類化合物[1]，2015版《中國藥典》收錄的槐的藥用價值有涼血止血、清肝瀉火[2]。槐樹的栽培品種主要有白槐、黃槐和金槐。其中，金槐是優良的槐樹栽培品種，金槐米中蕓香苷含量高，是其他品種的1～2倍，廣西全州縣金槐米的蕓香苷含量一般為25%～28%，最高可達到40%[3-4]，而槲皮素可由蕓香苷水解而成。槲皮素是近幾年來的研究熱點，具有抗氧化、抗變形鏈球菌生物膜活性、抗過敏、抗病毒和抗腫瘤等功效[5-7]，它在醫療和制藥行業有巨大的發展空間和應用前景，因此優化金槐米制備槲皮素的工藝方法對臨床應用及制藥是很有必要的。

目前，獲得槲皮素的方法主要有溶劑提取法[8]、超聲輔助提取法[9]、微波輔助提取法[10]和微生物發酵法[11-12]。微生物發酵是指在發酵過程中，利用微生物在生長代謝過程中所產的酶轉化中藥材中的有效成分[13]。有研究表明，槐米有效成分蕓香苷進入腸道后，通過微生物水解成槲皮素而發揮藥效[14]。該試驗以桂北金槐米為基質，利用青霉菌進行固態發酵，將金槐米中蕓香苷轉化成槲皮素，通過響應面法[15]優化金槐米的發酵工藝，為金槐米中蕓香苷的有效利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

金槐取自廣西壯族自治區全州縣，經廣西植物所蔣云生研究員鑒定為槐米;青霉菌由桂林醫學院基礎院病原微生物實驗室分離篩選;槲皮素對照品購自中國食品藥品檢定研究院，批號100081，含量99.1%;甲醇為色譜純，水為超純水;蔡氏培養基購自上海博微生物科技有限公司;分析天平購自上海精天電子儀器廠;高速多功能粉碎機購自永康市鉑歐五金制品有限公司;高效液相色譜儀（島津LC-20A）購自島津企業管理有限公司;恒溫振蕩器購自韶關市泰宏醫療器械有限公司。

1.2 種子液的制備

將菌種接種到斜面蔡氏培養基上，30 ℃恒溫條件下培養4～6 d，加入無菌水充分刮下孢子，制備孢子懸浮液，裝入含有100 mL種子液培養基的錐形瓶中，在30 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養箱中培養72 h，得到種子液。

1.3 固態發酵培養

將槐米干燥粉碎（過100目篩），稱取5 g槐米粉末，放入250 mL錐形瓶中，加入一定量的無機鹽蔡氏培養基，混合均勻，121 ℃高壓滅菌30 min。在無菌條件下，接入一定量的種子液后放于恒溫振蕩培養箱培養一定時間。

1.4 發酵工藝單因素試驗

發酵溫度對槲皮素含量的影響：發酵溫度24、26、28、30、32 ℃，接種量4 mL，搖床轉速160 r/min，時間5 d;發酵時間對槲皮素的影響：發酵時間3、5、7、9 d，接種量4 mL，搖床轉速160 r/min，發酵溫度30 ℃;搖床轉速對槲皮素的影響：轉速120、160、180、200、240 r/min，接種量4 mL，發酵溫度30 ℃，發酵時間5 d;接種量對槲皮素的影響：接種量1、4、7、10、13 mL，發酵溫度30 ℃，發酵時間5 d，搖床轉速160 r/min。

1.5 槲皮素含量的測定

1.5.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長365 nm，進樣量20 μL，流動相 ∶甲醇-水（60 ∶40）。

1.5.2 槲皮素含量標準曲線的繪制 精準稱取槲皮素對照品5 mg于50 mL容量瓶中，加色譜甲醇溶解，定容至刻度線，充分搖勻后置于4 ℃冰箱備用。精確稱量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL上述對照品溶液分別置于5 mL容量瓶中，用色譜甲醇定容。按上述色譜條件進樣并測定峰面積。試驗結果表明，槲皮素在2～12 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程：y=173.74x-106.53，r2=0.999 7。

1.6 響應面法優化試驗

根據單因素試驗結果，選擇發酵溫度、發酵時間、搖床轉速、接種量4個因素為自變量，槲皮素含量為響應值。根據Box-Benhnken設計原理，進行4因素3水平的響應面法分析試驗，因素水平設計詳見表1。采用Design Expert 8.0軟件對數據進行分析，得出最佳發酵工藝，試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度對槲皮素含量的影響 由圖1可知，槲皮素含量受發酵溫度的影響，發酵溫度為30 ℃ 時槲皮素含量最高，再繼續升高溫度，槲皮素含量下降。溫度過低時會減緩青霉菌的生長代謝，導致槲皮素含量較低;溫度升高時也會抑制菌體的生長或滅活。因此選擇30 ℃為最佳發酵溫度。

2.1.2 發酵時間對槲皮素含量的影響 由圖2可知，發酵時間為3～7 d時，槲皮素含量隨著發酵時間的延長而增加，發酵溫度在7 d時，槲皮素含量達到最大;隨著發酵時間再度增加，槲皮素含量略微下降。在發酵過程中，發酵時間過長，菌利用產物進行生長繁殖，導致槲皮素含量的減少。因此選擇7 d為最佳發酵時間。

2.1.3 搖床轉速對槲皮素含量的影響 由圖3可知，槲皮素含量隨轉速升高而逐漸增加，當轉速達到180 r/min時，槲皮素含量最高;當轉速再升高時，槲皮素含量下降并趨于平緩。轉速增加時溶氧量也相應增加，當轉速達到最佳值時，溶氧量也達到上限，轉速再繼續增加不會增加溶氧量[16]，因此選擇最佳搖床轉速為180 r/min。

2.1.4 接種量對槲皮素含量的影響 由圖4可知，接種量為1～4 mL時，槲皮素含量隨著接種量的增加而逐漸增加，接種量為4 mL時， 槲皮素含量達到最大;接種量繼續增加時，槲皮素含量下降。接種量的多少可以影響菌的生長繁殖速度，接種量過多時，菌體繁殖過快，導致菌體生長所需的營養物質不夠而利用槲皮素作為其營養物質的來源，降低了槲皮素含量[17]。因此選擇4 mL為最佳接種量。

2.2 響應面結果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析 根據單因素試驗結果，以發酵溫度、時間、轉速、接種量作為主要因素，根據BOX-Behnken Design設計原理，試驗設計和試驗結果詳見表2。

利用Design-Expert 8.0軟件對表2數據進行二次元回歸分析，可得出影響因素的關聯方程，多元回歸擬合分析得到模型的擬合方程為Y=34.75-0.48A-0.12B-1.05C+0.63D-0.74AB-0.21AC+1.78AD-0.17BC-2.68BD-0.78CD-8.12A2-7.43B2-8.98C2-7.80D2。

由表3可知，回歸方程顯著（P模型<0.000 1），失擬項不顯著（P>0.05），表明試驗模型中的二項式方程較符合實際發酵情況，較好地反映了發酵溫度、時間、轉速、接種量對槲皮素含量的交互作用具有高度顯著影響。

2.2.2 響應面交互作用分析 由圖5可知，固定發酵時間5 d，轉速160 r/min， 當發酵溫度不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當接種量不變時，槲皮素的含量隨著發酵溫度的升高先增加后減少;在發酵溫度和接種量處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

由圖6可知，固定發酵溫度30 ℃，轉速160 r/min，當發酵時間不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當接種量不變時，槲皮素含量隨著發酵時間的延長先增加后減少;在發酵時間和接種量處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

由圖7可知，固定發酵溫度30 ℃，發酵時間5 d，當轉速不變時，槲皮素含量隨著接種量的增加先增加后減少;當接種量不變時，槲皮素含量隨著轉速的增大先增加后減少;在接種量和轉速處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

由圖8可知，固定接種量4 mL，轉速160 r/min當發酵溫度不變時，槲皮素含量隨著發酵溫度的升高先增加后減少;當發酵溫度不變時，槲皮素含量隨著發酵時間的延長先增加后減少;在發酵時間和溫度處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

由圖9可知，固定發酵時間5 d，接種量4 mL當發酵溫度不變時，槲皮素含量隨著轉速的增大先增加后減少;當轉速不變時，槲皮素含量隨著發酵溫度的升高先增加后減少;在轉速和發酵溫度處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

由圖10可知，固定發酵溫度30 ℃，接種量4 mL 當發酵時間不變時，槲皮素含量隨著轉速的增大先增加后減少;當轉速不變時，槲皮素含量隨著發酵時間的延長先增加后減少;在轉速和發酵時間處于中間水平時槲皮素含量達到最大值。

2.3 驗證試驗

根據Box-Behnken優化試驗和回歸模型分析，得出金槐槐米最佳發酵條件為接種量3.93 mL、發酵溫度29.97 ℃、發酵時間6.88 d、轉速180.85 r/min，[CM（15*2/3]在此優化條件下槲皮素含量預計為4.81 mg/g。考慮到實際操作，為了便于試驗，在此基礎上調整發酵參數，確定最佳發酵工藝條件為接種量4 mL、發酵溫度30 ℃、發酵時間7 d、轉速180 r/min，重復3組平行試驗，得到槲皮素含量為33.67 mg/g，與預測值接近，證明了優化的固態發酵桂北金槐槐米工藝條件的準確性和可靠性。

3 討論

現行的槲皮素生產一般采用的是化學二步法工藝，而微生物發酵能將金槐米中的蕓香苷直接轉成槲皮素，且固態發酵對設備要求低、耗能低、污染小;發酵產物無需復雜的提取分離過程，這對進一步降低生產成本和環境污染具有實際的利用價值。微生物發酵是一個極其復雜的生化反應過程，在發酵工業中，其生產水平不僅取決于生產菌種的自身性能，還和發酵條件等外界環境有關，因此發酵培養基的優化對發酵水平的提高起著舉足輕重的作用[18-19]。為了獲得最佳發酵工藝，本試驗采用響應面法，與傳統優化方法相比，響應面法能通過直觀、精準度較高的數學模型對最佳工藝進行優化，將因素和結果的關系進行多項式擬合，優化出最佳青霉菌固態發酵金槐米轉化槲皮素的發酵工藝，最佳發酵工藝為接種量4 mL、發酵溫度30 ℃、發酵時間7 d、轉速180 r/min，此條件下槲皮素含量為33.67 mg/g。該試驗建立的數學模型可靠、合理，提高了工作效率，而且為進一步開發金槐中的蕓香苷轉化槲皮素提供了參考。

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