河蟹土池生態育苗敞池培養褶皺臂尾輪蟲Brachionus plicatilis的技術

邵力　肖佳華　宋小平　閔元棋　楊家新

摘要：土池生態育苗是目前江蘇沿海河蟹育苗的主導模式。通過敞水池塘開放式培養天然餌料（微藻-輪蟲）達到生產河蟹苗種的目的。敞池培養海水褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）即在生物餌料培育過程中，通過添加培育天然餌料微藻和補充外源性餌料按照一定配比提高輪蟲生產密度，延長輪蟲高峰期持續時間，實現河蟹“餌料微藻-輪蟲-河蟹幼苗”的土池生態育苗良性生產。通過在露天培育土池中，加入經過發酵的酵母懸液和無機氮肥（尿素）溶解液的方式，使輪蟲的高峰期（>1 200 ind./mL）時間維持5～6 d，最大密度達到3 320±35.78 ind./mL，比對照池最大密度（1 023±53.30 ind./mL）高出近2倍，由此可見，酵母加無機肥培養生物餌料的方式能相對縮短褶皺臂尾輪蟲達到峰值的時間，并能明顯提高種群的密度和延長輪蟲高峰期時間。

關鍵詞：河蟹;育苗;微藻;褶皺臂尾輪蟲;酵母;尿素;密度

中圖分類號： S963.21+4文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0198-05

褶皺臂尾輪蟲（Brachionus plicatilis）多數分布在鹽度較高的河口和近海區域，具有適應力強、生長快、游動緩慢等特點，適合大規模人工培養作為水產動物的開口生物餌料。由于輪蟲在水體中分散性好、營養價值高、無殘餌污染，能顯著提高育苗成活率和改善苗種品質，褶皺臂尾輪蟲是海產動物育苗不可或缺的開口餌料之一[1-2]。

江蘇是我國中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）育苗和養殖大省，大眼幼體產量占全國年總產量的60%以上[3]。中華絨螯蟹人工育苗技術的突破始于土池育苗，20世紀90年代中后期，以贛榆模式為代表的集約化育苗占據主導地位[4]，但缺乏成熟的生物餌料生產技術作為保障，受多種因素影響，集約化育苗模式重新被土池生態育苗技術所替代。生物餌料（輪蟲）的生產技術仍然是河蟹土池生態育苗的共性關鍵技術難題。主要表現如下：

（1）池塘資源占用過大。江蘇省是我國河蟹苗種的主要產區之一，土池生態育苗規模穩定在2 000～2 600 hm2左右，生產上一般需按面積比2 ∶1配置生物餌料池（主要是輪蟲餌料池），其中用于生物餌料的池塘約1 300～2 000 hm2。

（2）粗放生產，產量波動大。河蟹土池育苗是利用灘涂土池露天生產大眼幼體。餌料微藻來源于天然海水自帶的藻類，輪蟲主要來源于土池底泥沉積物中的休眠卵自然萌發，因此，生產過程無固定的優勢種（餌料微藻）。目前，絕大部分企業均采用較為粗放的靠天收模式生產生物餌料[5]。這種模式的缺點在于：餌料池輪蟲進入高峰期后一次采收，之后輪蟲種群無法再次進入高峰期，育苗期間，對生物餌料大量需求的時間段集中在10～20 d，具有較強的時效性。因此，盡管已經配置了專門餌料生產池，粗放式生產提供的生物餌料依然難以滿足生產所需。

（3）潛在環境風險突顯。目前，使用發酵雞糞作為基肥，利用海水天然餌料微藻生產輪蟲是育苗企業最常見的生產模式[6]。該模式最大的問題是雞糞攜帶的病原菌加入育苗水體以及畜禽養殖中抗生素的藥物殘留可能會通過食物鏈傳遞至蟹苗，給河蟹育苗甚至整個河蟹產業帶來巨大的潛在風險。同時，餌料池的尾（廢）水的排放與目前環境優先的政策相悖。

因此，針對江蘇河蟹土池生態育苗中共性關鍵技術，筆者于2018年4—5月在江蘇省射陽縣蟹苗養殖基地試驗初探并取得初步成果，現將試驗的主要技術要點和過程總結如下。

1 池塘條件

2口池塘分別作為對照池和試驗池，塘口均位于射陽東海海岸線，旁呈東西走向，水量充沛可靠，水質清新且無農藥等污染源。土為黏性土壤。池塘呈鍋底形，平均深度2 m，水深最深處達3 m，每口池塘的面積約1 hm2。

1.1 基肥

先對池塘進行清塘處理，方法為使用漂白粉30～50 g/m3，攪拌底泥，暴露于漂白粉環境處理3 d;待消毒處理結束后引進新鮮過濾海水，海水經過雞糞堆積口注入池塘，雞糞作為基肥一同注入輪蟲池進行肥水，雞糞使用量為60 m3/hm2;之后，分別在對照池和試驗池中接入等量的海水小球藻培養。

1.2 輪蟲接種

鏡檢，待藻類密度達到約1×106 ind./mL時，分別在對照池和試驗池中接入褶皺臂尾輪蟲，接種密度約400 ind./mL。

1.3 培養管理

試驗池培育過程使用尿素（主要成分為碳酰胺，江蘇晉煤恒盛化工股份有限公司生產）作為追肥肥料，并補充活化處理的酵母懸液（安琪酵母股份有限公司生產）。

培養期間，根據池塘浮游生物變化特點，使用尿素追肥1次，尿素使用量為90 kg/hm2左右，溶解后全池潑灑。之后，為防止餌料微藻不足，利用活化酵母補充，酵母用量60 kg/hm2左右，酵母活化按質量比100 ∶10 ∶1的比例添加水、酵母和紅糖，激活10 h，搖勻，靜置后取上清液潑灑，全池潑灑。在試驗期間未施用其他肥料，通常不換水，2個池塘不相通。

2 樣本采集與數據分析

采樣時間為每天08：00，在池塘四角和中間設置采水點，使用YSI水質分析儀現場測定理化因子。用13號和25號浮游生物網采集浮游植物和輪蟲進行定性定量分析，每個采水點采集的10 L水樣過濾濃縮至50 mL，用福爾馬林溶液固定并帶回室內鏡檢，檢測方法參照《淡水浮游生物研究方法》[7]，試驗周期為8 d。

采用SPSS 16.0中的單因素方差（one-way ANOVA）對數據進行統計分析，并進行多重比較，同時采用SigmaPlot 10作圖。

3 結果與分析

3.1 溶氧量、鹽度、電導率變化

3.1.1 溶氧量變化

試驗期間，對照池和試驗池的溶氧量變化趨勢基本一致，分別在培養3、1 d達到峰值[（12.90±0.42） mg/L 和（12.09±0.38） mg/L]，但試驗池溶解氧明顯低于對照池。高峰期過后從培養6 d 開始試驗池的溶氧量高于對照池（圖1）。

3.1.2 鹽度變化

如圖2所示，對照池和試驗池鹽度差異明顯，除培養7 d時對照池高于試驗池外，其他時間對照池均低于試驗池。對照池和試驗池分別在培養7、8 d達到最大值[（24.41±0.38）‰和（25.31±0.59）‰]，試驗池的鹽度在試驗時間較對照組變化更為穩定。

3.1.3 電導率變化

試驗池前6 d的電導率均高于對照池，且2組之間差異明顯。對照池電導率3 d達到最高值33.11±0.63 mS/cm，試驗池4 d達到最高值39.53±0.28 mS/cm，對照池僅在培養7 d時電導率高于試驗池（圖3）。

3.2 微藻種類組成

在試驗的8 d時間內，共檢測到常見藻類21種，添加尿素和酵母的試驗池的微藻不同種類出現的頻率明顯多于對照池。培養8 d時對照池和試驗池的藻類種類數量達到最大值，對照池11種、試驗池18種，藻類組成均以綠藻門為主，硅藻門次之。微藻種類出現頻率如表1所示。

3.3 浮游植物生物量和葉綠素含量動態變化

如圖4所示，2池浮游植物生物量的變化趨勢基本一致。對照池和試驗池培養3 d浮游植物生物量均達到最大值[（9.27±0.43） g/L和（10.33±0.51） g/L]，且試驗池植物生物量遠高于對照池。2池在前2 d生物量增長速度最快，且試驗池明顯快于對照池。2池分別在6 d生物量驟然下降至（2.06±0.33） g/L和（1.16±0.46） g/L。

試驗池的葉綠素含量在增速和峰值上明顯高于對照池，對照池和試驗池分別在培養2、3 d達到葉綠素含量的峰值[（187.1±9.36） g/L 和（209.56±4.10） g/L]。在培養6～8 d，2池的葉綠素變化趨勢與浮游植物生物量變化趨勢密切相關（圖5）。

3.4 輪蟲密度

由圖6可以看出，接種后，到培養6 d，輪蟲密度呈現指數增長，且試驗池培養6 d達到高峰期[（3 320±35.78） ind./mL]。對照池滯后，在培養7 d達到峰值（1 023±53.30） ind./mL，試驗池輪蟲高峰期早于對照池，密度明顯高于對照池。在試驗的8 d時間內，試驗組輪蟲在培養4 d開始出現爆發性增長，之后的4 d內，輪蟲密度均明顯高于對照池，且密度維持在1 000 ind./mL以上，持續時間達5 d，對照組整個試驗期間密度維持在1 023 ind./mL 以下。

4 討論與結論

4.1 尿素和發酵酵母添加對水質及微藻種類的影響

在河蟹育苗過程中，微藻不僅可以作為河蟹早期幼體和輪蟲的食物，而且對調節水質也具有重要作用，微藻的種類和密度常是河蟹育苗成功與否的關鍵[8]。本研究表明：輪蟲培養期間，在原有基肥基礎上，添加尿素作為追肥，利用活化酵母作為輪蟲餌料補充時，會對水體理化因子產生一定影響。通過浮游植物生物量和葉綠素含量分析可以得出，添加尿素追肥可促進土池中藻類的生長。同時，通過藻類組成變化可以看出，微藻種類以及優勢種亦隨添加無機肥和酵母而發生改變，試驗池培養5～8 d微藻的種類明顯多于對照組，可能是因為氮是浮游植物細胞內蛋白質、核酸等活性物質的重要組成成分，尿素的添加可以補充氮元素，從而引起微藻生長特性和生化組成的變化。有研究表明，藻類能利用各種形態的氮，如硝酸鹽、銨鹽、尿素[9-12]，但以尿素為氮源最好，硝酸鈉次之，氯化銨較差[13]。桑敏等的研究證明，適當增加氮的濃度可以促進微藻的生長，提高微藻產量[14]。磷則作為底物或調節物直接參與植物光合作用[15]。張青田等研究了尿素對幾種海洋微藻生長的影響情況，結果表明，尿素對球藻、硅藻等微藻的生長影響極顯著，但最適生長的濃度值均不同;同時他們還對N/P值的情況進行了探討，提出該比值可能和氮態有關[16]。這些研究都表明，尿素的添加會產生一系列的影響，這些影響包括理化因子的變化及其導致的池內微藻種類和優勢種的變化。

本研究結果顯示，在輪蟲池內添加適量的尿素能增加微藻種類多樣性，適宜性微藻能促進輪蟲的生長繁殖，因此建議在輪蟲生產中可以添加適量的尿素。

4.2 尿素和發酵酵母添加對輪蟲密度的影響

生物餌料的質量是決定河蟹溞狀幼體成活率和生長發育的關鍵因素之一。褶皺臂尾輪蟲是海水魚類和蝦蟹育苗的重要生物餌料，吳學軍等認為，由于褶皺臂尾輪蟲自身不能合成不飽和脂肪酸，通過酵母可以進行營養強化，而強化的輪蟲投喂的溞狀幼體在Z5-M階段的成活率也會更高[17]。

有關酵母對輪蟲生長的促進作用也已有相當多的研究，Ricci等的研究表明：在活藻喂食試驗中，微藻能促進輪蟲的成熟和產卵，而酵母飼料能有限維持輪蟲的繁殖狀態下及生長;酵母喂食試驗中，他們證實除了微藻類，輪蟲的食物也可考慮酵母，但單獨喂養酵母會導致營養缺乏，而以1 ∶1的方式提供酵母和擬微綠球藻可以使得輪蟲的生長速率與全部投喂擬微綠球藻的生長速率基本相同，在沒有足夠的藻類喂養輪蟲時，酵母是有效的輪蟲食物替代物[18]。王金秋等的研究也表明酵母和藻類搭配投喂對萼花臂尾輪蟲種群的增長速度有較大幅度的提高[19-21]，在褶皺臂尾輪蟲中也有相似的表現[22-24]。在本研究中，添加尿素和酵母的試驗池的輪蟲數量遠遠高于對照池，由此證明：發酵的酵母對輪蟲種群密度的增長有明顯的促進作用且輪蟲的高峰期（>1 200 ind./mL）可維持5～6 d，最大密度可達到（3 320±35.78） ind./mL，比對照池最大密度[（1 023±53.30） ind./mL]高出近2倍。

值得關注的是本試驗的3個理化因子（溶氧量、鹽度和電導率）。對照池的溶氧量高于試驗池，可能是由于試驗池輪蟲密度遠遠大于對照池，大量的輪蟲需要更多的氧氣進行呼吸作用從而導致溶氧量值較低。在鹽度方面，徐海龍等認為，鹽度在30‰左右時，褶皺臂尾輪蟲的種群密度和增殖率最大，鹽度超過30‰時，褶皺臂尾輪蟲和總種群密度呈下降趨勢，而處于15‰～30‰時，輪蟲密度也隨鹽度的升高而升高[25-27]。在本試驗中，由于添加了無機肥尿素和酵母，鹽度值明顯增高，且明顯高于對照池（鹽度低于30‰），輪蟲種群密度相應增大，試驗池輪蟲密度遠高于對照池，二者呈正相關關系，這與之前的研究成果一致。電導率能反映水體整體的營養水平，雞糞、尿素和酵母的添加使水體整體呈富營養化特征，水電導率處于較高水平。王魏根等人認為，在水體整體穩定的情況下，高電導率說明營養鹽多，有利于水體浮游生物的繁殖，輪蟲的密度也會增加[28-31]。本試驗中試驗池的電導率明顯高于對照池，輪蟲密度也明顯高于對照池，與之前的研究結果一致。

因此，本研究的結果顯示，在露天池塘培育輪蟲時，在原有基肥基礎上，添加尿素作為追肥，利用發酵酵母作為輪蟲餌料補充的方式能相對縮短褶皺臂尾輪蟲達到峰值的時間，并能明顯提高種群密度和延長高峰期時間。

綜合比較對照池和試驗輪蟲池的各種理化因子、微藻種類動態變化、輪蟲密度等，筆者認為：發酵酵母結合無機肥（尿素）培養生物餌料的方式能夠調節水質，促進微藻種類多樣化和輪蟲的生長，能夠有效維持輪蟲的高峰期且降低環境負荷，符合當期集約化生產和河蟹育苗的需要和未來發展的趨勢。

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