土壤鄰苯二甲酸二丁酯對白菜生長和抗氧化酶系統(tǒng)的影響

徐文君　程江峰

摘要：隨著工業(yè)的快速發(fā)展，鄰苯二甲酸酯（PAEs）作為增塑劑被大量使用，導(dǎo)致嚴重的環(huán)境污染，危害人體健康，鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）是PAEs中的重要成員，在土壤中富集的DBP極易被植株吸收而影響農(nóng)作物的生長。向土壤中人為添加DBP，并移栽上海青（Brassica rapa L.）幼苗，培養(yǎng)21 d后發(fā)現(xiàn)，植株根部及莖葉部分均被檢出有DBP存在，其中根部含量較高;與對照組相比，植株生長指標中的根長、生物量因受DBP脅迫而顯著減小，葉綠素含量無顯著性差異。植物抗氧化系統(tǒng)同樣受到影響，與對照組相比，H2O2含量、POD活性、CAT活性顯著升高，SOD活性以及MDA含量則無顯著性差異。由此說明，DBP脅迫下植株的生長狀況及抗氧化酶系統(tǒng)明顯被影響。

關(guān)鍵詞：鄰苯二甲酸酯（PAEs）;鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）;生物量;葉綠素含量;抗氧化酶系統(tǒng);白菜

中圖分類號： S634.301;Q945.78文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）07-0142-05

鄰苯二甲酸酯（PAEs）是一類用處廣泛的有機化合物，常溫情況下為無色黏稠態(tài)液體，微溶于水，不易揮發(fā)，熔沸點低，具有良好的黏著性、穩(wěn)定性、增加塑料柔韌與可塑性等特點[1]，因此以增塑劑的作用在塑料生產(chǎn)中被大量使用[2]，此外也被用于化妝品、膠水、洗車內(nèi)飾、家具、農(nóng)藥、香料、保鮮膜等塑料制品中[3-4]。但由于人們對PAEs的大規(guī)模利用，目前已經(jīng)在大氣塵埃、工業(yè)廢水、河流湖泊、土壤、動植物甚至人體中被普遍檢出[5]。它不但具有生殖毒性，還有致癌、致畸、致突變的危害[6-7]，目前被美國環(huán)保局（EPA）列入129種重點控制污染物名單，也被歐盟委員會和中國環(huán)境監(jiān)測總站列為優(yōu)先監(jiān)測污染物[8-10]。

研究發(fā)現(xiàn)，我國土壤中PAEs的含量基本在mg/kg 至g/kg數(shù)量級[11]。土壤中PAEs的主要來源是農(nóng)田塑料薄膜、垃圾以及污水灌溉[12-13]，其含量與所處地域有極大的關(guān)系，越靠近工業(yè)區(qū)，PAEs的含量越高，其中以鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）以及鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）的檢出率最高[14]，這是因為塑料膜的原材料中有大量的PAEs，由于PAEs與聚氯乙烯（PVC）樹脂間并不是以共價鍵這種穩(wěn)定的方式連接，而是通過范德華力或氫鍵等不穩(wěn)定方式連接，所以隨時間推移塑料膜中的PAEs被大量釋放到土壤及環(huán)境中[15]，而富集在土壤中的PAEs最終會被作物吸收進入植株體內(nèi)，進而通過食物鏈進入動物及人體內(nèi)[16]，嚴重破壞生態(tài)環(huán)境，危害人體健康。因此，針對土壤PAEs的污染現(xiàn)狀，選擇合適的代表污染物以及作物，通過檢測分析污染物對作物的脅迫影響顯得尤為重要。

本試驗選擇PAEs中的重要成員DBP為主要研究污染物，葉菜類蔬菜上海青（Brassica rapa L.）為研究作物，向土壤中人為添加高濃度DBP制成污染土，移栽上海青，培養(yǎng)21 d后研究植株的根長、生物量、葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量、過氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫（H2O2）含量、過氧化氫酶（CAT）活性，并利用高效液相色譜（HPLC）檢測DBP污染土壤中栽培的上海青莖葉部分、根部以及土壤中的DBP含量，以期能夠從一定程度上明確DBP對植株的脅迫影響，為塑化劑污染土地的作物栽培及防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植株及土壤 以采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田的土樣為試驗土壤，購自南京綠領(lǐng)種業(yè)有限公司的上海青種子為供試作物種子。

1.1.2 主要試劑 鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）（上海安普實驗科技股份有限公司，含量>98.5%）;色譜純乙腈、分析純丙酮（德國Merck KGaA公司）;氯化鈉（NaCl，上海久億化學(xué)試劑有限公司）;無水硫酸鎂（MgSO4，成都市科隆化學(xué)品有限公司）;N-丙基乙二胺（PSA）、石墨化炭黑（GCB）（天津博納艾杰爾科技有限公司）。將DBP標準品溶解于丙酮溶液中，使用前在-20 ℃下封閉存儲。

1.1.3 儀器設(shè)備 WH-3微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）;Centrifuge 5804R型離心機（EPPENDORF公司）;JJ223BC型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）;Agilent Technologies 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）;SPAD502葉綠素含量測定儀、KQ-600E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;IKA型組織勻漿機（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）;T18基本型高速分散機（德國IKA儀器設(shè)備有限公司）。

1.1.4 試劑盒 南京建成科技有限公司總蛋白定量測定試劑盒（比色法）;南京建成科技有限公司過氧化氫含量測定試劑盒（比色法）;南京建成科技有限公司過氧化氫酶活性測定試劑盒（可見光法）;南京建成科技有限公司過氧化物酶活性測定試劑盒（測植物）（比色法）;南京建成科技有限公司總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性測試盒（羥胺法）;南京建成科技有限公司植物丙二醛（MDA）含量測定試劑盒（微板法）。

1.2 試驗設(shè)計

取采自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗田的土壤若干，過10目篩后作為空白土，取其中一部分空白土加入一定濃度的DBP丙酮溶液，晾干后攪拌混勻，作為DBP污染土，將上述2種土壤均勻鋪在鐵盤中，保持一定的土壤深度以及其他良好的培養(yǎng)條件，待植株移栽。供試植株為溫室土壤培養(yǎng)下長勢一致（3葉1心）的上海青幼苗。將上海青幼苗移栽到DBP污染土中作為DBP處理組，移栽到空白土中作為對照組，在水分充足光照良好的條件下培養(yǎng)21 d后，分別檢測土壤、植株莖葉、根部中的DBP含量，同時測量植株的根長、生物量、葉綠素含量過氧化氫含量以及MDA、SOD、POD、CAT活性。以上所有處理均設(shè)5個重復(fù)，除土壤不同外，光照時間、光照度、澆水時間、澆水量、溫度、濕度等其他培養(yǎng)條件均保持一致。

1.3 試驗方法

1.3.1 DBP的提取分析方法 由于土壤及植物中含有極多雜質(zhì)，本試驗采用最近研發(fā)的QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）方法[17]，利用吸附劑來吸附樣品中雜質(zhì)，從而達到提取、凈化的目的。（1）土壤中DBP提取：稱取土壤樣品2.0 g置于10 mL玻璃具塞離心管中，加入6 mL乙腈，超聲30 min 后進行提取;加入1.0 g氯化鈉渦旋振蕩1 min;取2 mL上清液，加入50 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA，渦旋振蕩1 min以充分凈化，靜置3 min 后取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進HPLC進行檢測。（2）植株中DBP提取：將植株的根、莖、葉分別于組織勻漿機中加入液氮均勻打碎后，稱取樣品1.0 g置于10 mL 玻璃具塞離心管，加入3 mL乙腈，超聲30 min 后進行提取;加入1.0 g氯化鈉渦旋振蕩2 min，取2 mL上清液，加入50 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和30 mg GCB，渦旋振蕩5 min 以充分凈化，靜置5 min后取1 mL上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進HPLC進行檢測。[JP3]HPLC條件：色譜柱為ZORBA×SB-AQ柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相為V（乙腈） ∶V（水）=85 ∶15;流速為0.9 mL/min;檢測波長為225 nm;柱溫為室溫;進樣量為20 μL。在上述條件下DBP的保留時間為4.2 min，該方法下土壤中DBP的回收率為83.3%，相對標準偏差（RSD）為4.1%;青菜中DBP的回收率為80.5%，RSD為5.5%。

1.3.2 生物量、根長及葉綠素含量測定方法 將移栽培養(yǎng)21 d后的上海青從土壤中取出，盡量減少根部損傷，將根部用清水清洗干凈后，用吸水紙將水分吸干，測量并記錄根長，然后對整個植株稱質(zhì)量并記錄，利用SPAD502葉綠素含量測定儀測定植株的葉綠素含量，對植株多張葉片進行測量，然后取平均值并記錄。

1.3.3 抗氧化酶活性及可溶性蛋白、過氧化氫含量的測定方法 將移栽培養(yǎng)21 d后的上海青從土壤中取出，盡量減少根部損傷，將根部用清水清洗干凈后，用吸水紙將水分吸干，加入相應(yīng)體積提取液，在冰水浴條件下進行機械勻漿，制成一定濃度的組織勻漿，均勻稱取1 mL樣品，采用對應(yīng)試劑盒測定酶活性。

可溶性蛋白含量測定：采用BCA法測定植株鮮樣中的可溶性蛋白含量，其原理是在堿性條件下，蛋白質(zhì)可將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在562 nm處有最大吸收峰，依據(jù)吸光度與濃度成正比，通過測得的吸光度即可計算出待測蛋白的濃度，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

過氧化氫含量測定：采用分光光度法測定植株鮮樣中的過氧化氫含量，其原理是過氧化氫可以與鉬酸作用生成一種絡(luò)合物，該絡(luò)合物在405 nm處有最大吸收峰，通過測定吸光度可以計算出過氧化氫的量，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

過氧化氫酶（CAT）活性測定：采用分光光度法測定植株鮮樣的過氧化氫酶活性，其原理是過氧化氫酶分解過氧化氫的反應(yīng)可以通過加入鉬酸銨而迅速終止，剩余的過氧化氫與鉬酸銨作用產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，通過測定405 nm處的吸光度變化，可計算出CAT活性，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

過氧化物酶（POD）活性測定：利用過氧化物酶催化過氧化氫反應(yīng)的原理，通過測定420 nm處吸光度的變化得出酶活性，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

超氧化物歧化酶（SOD）活性測定：采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，其原理為SOD是一種重要的抗氧化劑，能夠催化植物細胞內(nèi)O-2· 發(fā)生歧化反應(yīng)，生成H2O，清除細胞內(nèi)過量的O-2· ，保護細胞膜系統(tǒng)免遭氧化損傷。細胞內(nèi)O-2· 能氧化經(jīng)胺生成NO2，發(fā)生顯色反應(yīng)，呈現(xiàn)粉紅色，當(dāng)SOD消除O-2· 后，NO2生成量減少，通過測定450 nm處的吸光度變化，即可計算出SOD活性，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

植物丙二醛（MDA）含量測定：采用硫代巴比妥酸（TBA）顯色法測定植株鮮樣中丙二醛含量，其原理為過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在532 nm處有最大吸收峰，具體步驟按試劑盒說明書進行，計算公式為

MDA含量=[SX（]D532 nm測定值-D532 nm空白值D532 nm標準值-D532 nm空白值[SX）]×標準品濃度÷樣本濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海青對土壤中DBP的吸收情況

將上海青種子置于溫室中土培一段時間后，將長勢一致的3葉1心上海青幼苗取出，分別檢測植株莖葉部分及根部的DBP含量，通過高效液相色譜并沒有檢測到DBP的存在。植株移栽前為驗證處理土壤中是否有DBP存在，測定土壤樣品中的DBP含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組初始土壤中的DBP含量為（127.6±3.1） mg/kg，植株移栽后分別對莖葉部分和根部的DBP含量進行檢測，檢測結(jié)果（圖1）表明，上海青植株能吸收土壤中的DBP，而且根部含量顯著高于地上莖葉部分，根部DBP含量為（1.21±0.07） mg/kg，莖葉部分為（0.25±0.01） mg/kg。

2.2 DBP脅迫對植株生長指標的影響

生物量指某一特定時刻生物有機體物質(zhì)的總量，是反映植物生長情況的最基本指標。在上海青移栽培養(yǎng)21 d后，分別測定DBP處理組和空白對照組植株的根長、生物量及葉綠素含量，這些生理指標可以間接地說明植株的生長情況。試驗結(jié)果（圖2）顯示，空白對照組的根長為（18.17±1.26） cm，DBP處理組的根長為（12.83±1.04） cm;空白對照組的生物量為（35.55±2.88） g，DBP處理組的生物量為 （19.29±2.91） g;空白對照組葉綠素含量的對應(yīng)SPAD值為46.91±1.89，DBP處理組葉綠素含量的對應(yīng)SPAD值為46.78±1.03。可以看出，DBP處理組的根長及生物量與空白對照組之間存在顯著性或極顯著性差異，說明空白對照組的植株發(fā)育比DBP處理組要好，DBP脅迫使植株生長受到了影響;而2組處理的葉綠素含量則沒有顯著性差異，說明DBP對植株的脅迫沒有對植株的葉綠素含量產(chǎn)生明顯影響。

2.3 DBP脅迫對植株抗氧化酶系統(tǒng)的影響

植株體內(nèi)的活性氧（ROS）在正常的生命活動情況下處于一種動態(tài)平衡的狀態(tài)，而一旦受到外界環(huán)境脅迫影響就會產(chǎn)生波動，H2O2、MDA含量可以直觀地體現(xiàn)植株的ROS水平，當(dāng)植株H2O2含量過高時，植株就會產(chǎn)生大量的CAT以減少H2O2，而植株MDA含量則依靠SOD及POD來降解，以保持ROS的動態(tài)平衡。由表1可見，DBP處理組的植株H2O2含量為（6.78±0.47） mmol/g，空白對照組為（4.34±0.39） mmol/g;DBP處理組的植株SOD活性為（781.61±33.82） U/g，空白對照組為（757.86±89.39） U/g;DBP處理組的植株MDA含量為（99.89±5.44） nmol/g，空白對照組為（97.09±14.32） nmol/g;DBP處理組的植株CAT活性為（6.25±0.46） U/mg，空白對照組為（4.68±0.12） U/mg;DBP處理組的植株P(guān)OD活性為（24.42±1.31） U/mg，空白對照組為（19.18±0.55） U/mg。相對于空白對照組，DBP處理組植株的H2O2含量、POD活性、CAT活性都顯著升高（P<0.05），而SOD活性、MDA活性的升高未達到顯著水平。

3 討論

近年來隨著社會工業(yè)化的迅速發(fā)展，PAEs在全球的消費量已經(jīng)達到了每年約600萬t[18]，由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在環(huán)境中的自然降解十分緩慢，水解半衰期少則3年，多則高達兩千多年[19]，且通常即便降解也無法徹底礦化，依然會產(chǎn)生有害的中間代謝產(chǎn)物[20-21]，其中的類激素有毒物質(zhì)會通過各種[LL]渠道散播到周圍的環(huán)境中造成環(huán)境污染，且對人類毒害。

就目前來講，PAEs作為土壤中最嚴重的有機污染物之一，已經(jīng)在我國不同區(qū)域的農(nóng)田土壤中被廣泛檢出，且個別地區(qū)超標嚴重[22]。這些富集在土壤中的PAEs會被土壤中種植的作物吸收，但不同作物對土壤中PAEs的吸收情況不盡相同，有些作物對PAEs的吸收極其明顯，有的則吸收很少。如在珠江三角洲的蔬菜基地中蔬菜樣品中的PAEs總含量為0.46～12.02 mg/kg[23]，而尹睿等則發(fā)現(xiàn)，番茄、胡蘿卜和蘿卜對DEHP的吸收量很少[24-25]。造成這種現(xiàn)象的原因很復(fù)雜，包括作物種類、土壤類型、PAEs污染濃度和生長條件等原因[26]。而在本試驗中可以明顯看到，上海青對DBP的吸收很明顯，且根部含量大于莖葉部分。

作物吸收PAEs后不僅會嚴重影響產(chǎn)量及質(zhì)量，也會對最終食用的動物及人類產(chǎn)生難以想象的毒害作用。有研究表明，當(dāng)土壤中的DBP及鄰苯二甲酸二異丁酯（DIBP）含量超過20 mg/kg時，會對其上生長的辣椒產(chǎn)生顯著的抑制作用[27]。宋廣宇通過研究發(fā)現(xiàn)，紅壤中的PAEs檢出率高，并且在含PAEs的紅壤中生長的上海青成活率很低，對上海青有顯著的抑制生長作用[12]，其研究結(jié)果與本試驗得到的結(jié)果一致。

植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)由SOD、POD及CAT組成，對因受到環(huán)境脅迫而產(chǎn)生過量ROS的調(diào)控是極其重要的[28]。當(dāng)植株受到外界脅迫時，會產(chǎn)生大量的ROS使植物膜脂過氧化而產(chǎn)生MDA，而當(dāng)植株體內(nèi)的ROS含量超過一定水平一段時間以后，會對植株造成永久性損傷，甚至導(dǎo)致植株死亡。劉春曉等發(fā)現(xiàn)，高濃度的DBP不僅會抑制藻類生長，還會降低其SOD和CAT的活性[29]。從本試驗結(jié)果可以看出，與對照相比，DBP脅迫處理下的植株H2O2含量、CAT活性顯著提高，說明植株確實會因受到DBP脅迫而過氧化，體內(nèi)的大量H2O2會使植株啟動抗氧化酶系統(tǒng)，產(chǎn)生大量CAT以降解過量的H2O2;而植株的MDA含量、SOD活性無顯著性變化，結(jié)合植株體內(nèi)的DBP含量來看，這可能是因為植株體內(nèi)的DBP含量并不高，無法產(chǎn)生過量ROS使植物發(fā)生膜脂過氧化，也有可能是因為在培養(yǎng)過程中大量的MDA刺激抗氧化酶系統(tǒng)，從而產(chǎn)生大量POD將其降解。綜合來看，DBP確實對上海青的抗氧化酶系統(tǒng)有一定影響。

研究PAEs污染土壤對作物的危害及修復(fù)是十分重要的，不但有助于制定治理修復(fù)措施，而且對環(huán)境保護和人類健康具有重要的意義。本研究從植株生長指標和抗氧化酶系統(tǒng)2個方面來闡述DBP對上海青的脅迫影響，可對PAEs污染土壤的作物種植及植物修復(fù)模型的構(gòu)建提供理論依據(jù)。

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