抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 定性PCR 檢測方法

李蔥蔥 謝蘋 董立明 夏蔚 蘭青闊 閆偉 龍麗坤 李飛武

（1. 吉林省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，長春 130033；2. 天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381）

根據農業生物技術應用國際服務組織（International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Applications，ISAAA）最新統計顯示，2017 年全球轉基因玉米種植面積達到5 970 萬hm2［1］。轉基因技術已成為新的農業科技革命的強大動力。隨著轉基因作物種植面積的持續增長和全球公眾對于轉基因植物及其產品安全性的關注度不斷提升，包括我國在內的全球62 個國家相繼頒布實施了轉基因生物標識管理制度［2-3］。根據我國《農業轉基因生物安全管理條例》及其配套管理規章的規定，我國對農業轉基因生物及其產品實行安全評價、產品標識、生產許可、經營許可、進口許可、加工許可等制度。其中，針對各個轉基因作物轉化體建立特異、靈敏、標準化的檢測方法是保證標識管理制度順利實施的重要技術支撐［4］。

轉基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 是由北京奧瑞金公司研發的轉mG2-aroA基因和mcry1Ah基因抗蟲耐除草劑玉米新品系。研發人采用農桿菌轉化法，將mG2-aroA和mcry1Ah兩個外源基因的表達框導入玉米受體中，然后通過多代篩選獲得對玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲具有抗性、耐草甘膦除草劑的轉基因玉米GH5112E-117C 轉化體［5］，該轉化體正在申請生產應用安全證書階段，在我國具有重要產業化應用前景。建立GH5112E-117C 玉米的檢測方法，將對該轉化體的安全評價、行政監管和知識產權保護提供重要的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 轉基因玉米GH5112E-117C、轉 基 因 玉 米 混 合 樣 品（Bt11、Bt176、MON810、M O N 8 6 3、G A 2 1、N K 6 0 3、T 2 5、T C 1 5 0 7、MON88017、MIR604 每種轉化體含量為1%，以非轉基因玉米為填充物）；轉基因大豆混合樣品（包括GTS40-3-2、MON89788、A2704-12、A5547-127、356043、305423、CV127 每種轉化體含量為1%，以非轉基因大豆為填充物）；轉基因水稻混合樣品（包括科豐6 號、科豐8 號、克螟稻、M12、TT51-1 每種轉化體含量為1%，以非轉基因水稻為填充物）；轉基因棉花混合樣品（包括MON1445、MON531、MON15985、LLCOTTON25、MON88913 每種轉化體含量為1%，以非轉基因棉花為填充物）；轉基因油菜混合樣品（包括MS1、MS8、RF1、RF2、RF3、T45、Oxy235、Topas19/2 每種轉化體含量為1%，以非轉基因油菜為填充物）；非轉基因玉米樣品。以上樣品均由本實驗室收集保存。

植物基因組DNA 提取試劑盒；Taq DNA 聚合酶、dNTPs 等PCR 試劑；其他生化試劑（分析純）。

1.1.2 儀器與設備 C1000 型梯度PCR 儀；GelDoc XR+凝膠成像系統；ND8000 紫外可見光分光光度儀。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA 提取 將所有樣品研磨成粉末，按照北京天根公司的植物基因組DNA 提取試劑盒操作說明書，提取樣品基因組DNA，用紫外可見光分光光度儀測定DNA 質量和濃度，用1×TE 緩沖液將純化的DNA 溶液稀釋至25 mg/L，4℃保存備用。

1.2.2 引物設計 根據奧瑞金公司提供的GH5112E-117C 玉米外源載體插入片段的5′端和3′端側翼序列信息，采用引物設計軟件Primer Premier 5.0，綜合考慮核苷酸序列GC 含量和引物Tm 值，設計 了1 對PCR 檢 測 引 物，GH5112-117C-F：5′- ACCAGCACCAGGTCCGAGTTGAGA -3′；GH5112-117C -R：5′- CCCAGGTACATTAAAAACGTCCGC -3′，擴增產物大小為179 bp。引物由上海生工有限公司合成，用1×TE 緩沖液稀釋至10 μmol/L 的工作液。

1.2.3 PCR 反應 優化后的PCR 反應體系包括：10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 混合溶液2 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、HS Taq DNA 聚合酶0.625 U、DNA 模板50 ng，用ddH2O 補齊至25 μL。優化后的PCR 擴增程序為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行35 個循環；72℃ 5 min；10℃保存。PCR 擴增結束后，取10 μL 擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

2 結果

2.1 特異性檢測

將抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 制備成質量分數為1%的粉末作為測試樣品，利用5 種轉基因作物混合樣作為比對樣品，對建立的抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 定性PCR 方法進行特異性測試，測試樣品和比對樣品均以轉基因材料與非轉基因材料作為填充物進行混合磨制而成，提取DNA 按照要求進行PCR 反應。

檢測結果（圖1）表明，僅從含有GH5112E-117C 玉米的測試樣品中擴增到179 bp 的預期DNA片段，而在其他樣品中均未擴增到預期大小的條帶，表明建立的抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 玉米檢測方法具有高度特異性。

2.2 靈敏度測試

將抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 與其非轉基因按不同質量比混合，制成GH5112E-117C 轉化體質量分數分別為1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%的樣品，提取基因組DNA，進行PCR 擴增。

圖1 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的特異性測試

結果（圖2）顯示，利用建立的方法在PCR 檢測反應體系中加入50 ng DNA 模板，在GH5112E-117C 轉化體含量為0.05%及以上的樣品中均能穩定得到與預期大小一致的擴增產物，表明方法的靈敏度可達到0.05%。

圖2 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的靈敏度測試

在使用普通PCR 進行轉基因成分定性檢測時，一般要求方法的檢測限應穩定達到0.1%。根據國際公認的檢測限判定程序，隨機稱取60 份GH5112E-117C 玉米質量分數為0.1%的樣品，提取基因組DNA，用本方法進行測試。結果如圖3 所示，60 份試樣中連續59 次檢出預期片段，表明在PCR 檢測反應體系中加入50 ng DNA 模板時，本方法的檢出限為0.1%，適用于對抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 品系的高靈敏檢測。

2.3 加工品測試

加工品中的高溫處理過程往往會降解DNA，對轉基因檢測有較大的影響。為測試本研究建立的GH5112E-117C 玉米檢測方法對加工品的適用性，采用兩種常用的高溫方法制備了2 份GH5112E-117C 玉米加工品，1 份是將質量分數為1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末制成玉米面窩頭，并蒸熟；另一份是將質量分數為1.0%的GH5112E-117C 玉米粉末在121℃下高溫高壓處理20 min。提取2 份加工品的基因組DNA，進行PCR 擴增。結果（圖4）表明，利用建立的方法在2 份加工品中均能特異性地擴增到179 bp 的預期產物，表明該方法適用于GH5112E-117C 玉米加工品的定性PCR 檢測。

圖3 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法的檢出限測試

圖4 抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 檢測方法對加工品的測試

2.4 穩健性測試

針對PCR 檢測方法的反應體系和反應程序，選擇退火溫度和引物濃度梯度兩個關鍵參數進行正交試驗。設置50、52、54、56、58 和60℃等6 個 退火溫度，0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L 和0.5 μmol/L 等5 個引物濃度梯度，每對引物共測試30 個退火溫度/濃度梯度組合。結果（圖5）表明，在不同的引物濃度和退火溫度處理中本方法均表現出非常好的擴增特異性，而且，當引物終濃度為0.2 μmol/L 時，不同退火溫度表現出較為一致的擴增效率，特異性擴增條帶清晰、無非特異擴增、引物二聚體較少。綜合考慮玉米內標準基因zSSIIb的定性PCR 檢測方法的反應體系和反應程序，結合本研究結果，反應體系中的引物終濃度確定為0.2 μmol/L，反應程序中的退火溫度設定為58℃。

3 討論

隨著轉基因技術的發展，全球轉基因玉米種植面積持續增長和全球公眾對于轉基因植物及其產品安全性的關注度不斷提升，轉基因玉米的研發也迅速發展［6］。轉基因玉米檢測方法的研發，對農業轉基因生物及其產品實行安全評價、產品標識、生產許可、經營許可、進口許可、加工許可等制度的實施提供了重要技術支撐［7］。

在轉基因產品檢測過程中，PCR 技術因其特異性強、靈敏度高、重現性好，應用最為廣泛［8］。根據所檢測的目的DNA 片段的特異性差異，轉基因產品PCR 檢測方法又可分為篩選、基因特異性、構建特異性和轉化體特異性4 類［9］。其中，轉化體特異性PCR 檢測方法以轉基因生物的旁側序列（與外源插入片段連接的受體基因組序列）與外源插入片段的連接即轉化體特異序列為檢測對象，具有高度特異性，已逐步成為國際上轉基因產品檢測方法標準的首選［10］，我國近年來發布的檢測方法標準絕大多數為轉化體特異性檢測方法。本研究開發的方法是精準檢測轉基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 的一種新的技術手段。該方法具有低成本、便利、普及性高的技術優勢，但是檢測通量、精準定量和自動化檢測方面。還存在一定的技術弊端。因此，本研究下一步將開發該轉化體實時熒光PCR［11］和數字PCR 方法［12］。

4 結論

本方法以轉基因抗蟲耐除草劑玉米GH5112E-117C 轉化體特異性DNA 序列為靶標，能特異性地檢測樣品中是否含有GH5112E-117C，檢測靈敏度可穩定達到0.1%。