防己諾林堿對糖皮質激素誘導雄性骨質疏松大鼠影響的研究

徐志平 卞龍艷 聞純

江蘇醫藥職業學院基礎教研室，江蘇 鹽城 224005

骨質疏松是一種常見的骨骼疾病，影響全球20多億人[1]。骨質疏松的特征是骨密度降低，骨強度降低，骨組織結構發生改變[2]。女性絕經后骨質疏松導致骨折風險增加。在中國，40.1%的50歲以上女性患有骨質疏松。骨重建隨著成骨細胞骨形成減少和破骨細胞骨吸收增加而改變[3]。骨密度(bone mineral density, BMD)在骨質疏松篩查中用于評估和診斷[4]。骨微觀結構的改變和骨密度的降低導致機械強度降低，微型計算機斷層掃描(Micro-CT)也被用來診斷骨質疏松[5]。目前已建立了幾種骨質疏松動物模型，糖皮質激素誘導的骨質疏松是最常見的骨質疏松模型之一[6]。文獻[7]表明，糖皮質激素治療使骨基質形成減少，骨吸收增加，從而減少了骨細胞和成骨細胞的產生。此外，糖皮質激素可減少成骨細胞的自噬并誘導其凋亡[8]。糖皮質激素通過促進Bcl-2的表達和下調Bcl-xl的表達而引起細胞凋亡[9]。在過去的幾十年中，替代醫學在治療包括神經性疾病在內的幾種疾病方面顯示出了潛力。防己諾林堿是一種生物堿，據報道[10]具有抗炎活性。防己諾林堿還具有很強的自由基清除、降壓、抗癌、抗氧化、抗血栓等作用[11]。因此，本研究將探討防己諾林堿對骨質疏松和骨丟失的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

12周齡雄性Wistar大鼠，體重240～280 g，購自上海動物史萊克公司。將動物飼養在濕度(60±5)%和溫度(26±2)℃的環境中，具有12 h夜間/白天循環。化學品防己諾林堿購自Sigma Aldrich(CA，USA);TRIzol試劑和cDNA合成試劑盒購自Thermo Fisher Scientific(MA，USA);Lowry蛋白質測定試劑盒購自Bio-Rad Laboratories(CA，USA);抗Bcl-2抗體(1∶400)、抗caspase-3(1∶500)、抗BMP2(1∶800)、抗Beclin-1(1∶600)和抗RANKL(1∶1 000)從Santa Cruz Biotechnology(TX，USA)獲得;抗LC3(1∶1 000)和抗GAPDH(1∶1 500)來自Cell Signaling Technology(MA，USA)。

1.2 方法

1.2.1研究方案：將所有動物分成5個獨立研究的組：未治療的對照組(A組);潑尼松龍治療組(B組)皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿低劑量組(C組)給予腹腔注射防己諾林堿(1 mg/kg)聯合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿中劑量組(D組)給予腹腔注射防己諾林堿(3 mg/kg)聯合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg);防己諾林堿高劑量組(E組)給予防己諾林堿(10 mg/kg)聯合皮下注射潑尼松龍(2.5 mg/kg)。治療1個月后評估防己諾林堿對骨質疏松癥的影響。

1.2.2檢測指標評估：在治療方案結束時，分離大鼠雙側股骨并在室溫下用1%甲醛固定過夜，然后在室溫下浸入70%乙醇中2 h。使用微型CT儀器SCANCO圖像處理語言軟件。使用雙能X線DCS-600 Aloka骨密度儀測量分離骨樣品的BMD。將動物麻醉后收集血液進行生化參數的評估，2 000 r/min, 離心10 min分離血清。根據制造商的說明，使用自動分析儀在血清中測定堿性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的活性以及磷和鈣的濃度。ELISA試劑盒用于測定I型片段膠原(CTX)和骨鈣蛋白(OC)蛋白的血清濃度。

1.2.3反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)：在治療方案結束時，從所有動物中分離脛骨組織，并按照制造商給出的說明使用TRIzol試劑提取總RNA。根據cDNA合成試劑盒制造商的說明，從RNA反轉錄cDNA。使用StepOne實時PCR系統進行定量PCR，并將GAPDH用作內部對照。通過在95 ℃熱循環10 min進行PCR，然后在95 ℃、45 ℃、60 ℃下進行40個循環15 s，最后延伸步驟95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s。使用的引物是核因子-κB配體(RANKL)、自噬蛋白(ATG)5、Runt相關轉錄因子(RUNX)2、Beclin-1、骨形態發生蛋白2(BMP2)和GAPDH的受體激活劑。比較Cq方法用于測定相對基因表達，GAPDH用作內部對照。

1.3 統計學處理

所有數據均表示為均數±標準差。使用單向ANOVA進行統計分析。 通過Dunnett的事后檢驗(GraphPad Prism 6.1，CA，USA)進行多重比較。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 防己諾林堿對微結構參數和BMD的影響

顯微CT分析顯示出防己諾林堿對潑尼松龍誘導的骨質疏松大鼠股骨干骺端的骨損失影響(圖1、表1)。與對照組相比，在潑尼松龍組中發現的微結構參數如骨表面密度、小梁骨組織體積密度、小梁數和小梁數厚度顯著降低(P<0.05，P<0.01)。然而，用防己諾林堿治療顯著減弱了潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨干骺端微結構參數的改變。潑尼松龍組的骨密度[(0.128±0.007) g/cm3]顯著低于對照組[(0.297±0.013)g/cm3)]。與潑尼松龍組相比，防己諾林堿治療組的BMD顯著增加至(0.273±0.017) g/cm3。

2.2 防己諾林堿對大鼠血清生化參數的影響

本研究進一步評估了防己諾林堿對潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠血清生化指標的影響，如圖2所示。與對照組相比，潑尼松龍組大鼠血清中

圖1 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質疏松大鼠股骨三維重建顯微CT圖像的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。Fig.1 Assessment of the effect of fangchinoline on 3D-reconstructed micro-CT images of the femur of the prednisolone-induced osteoporosis rats

組別骨表面小梁密度/mm-1骨小梁體積骨密度/%小梁數目/mm-1小梁厚度/mm骨密度/(g/cm3)A組3.92±0.4237.21±2.971.42±0.0360.279±0.0410.297±0.013B組2.36±0.28##22.49±1.42##0.83±0.028##0.246±0.017#0.128±0.007##C組2.61±0.3326.33±1.690.94±0.0190.258±0.0230.163±0.004*D組3.17±0.29**32.84±2.16**1.27±0.023**0.264±0.014*0.236±0.011**E組3.72±0.32**36.42±2.46**1.58±0.031**0.283±0.031*0.273±0.017**

注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。

圖2 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質疏松大鼠血清生化指標的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.2 Assessment of the effect of fangchinoline on biochemical parameters in the serum of prednisolone-induced osteoporosis rat model

ALP和TRAP活性以及Ca、P和CTX水平顯著增加(P<0.01)。此外，與對照組相比，潑尼松龍組大鼠血清中OC水平顯著降低(P<0.01)。用防己諾林堿治療改變了潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠血清中的生化參數，例如ALP和TRAP的活性以及Ca、P、OC和CTX的水平。

2.3 防己諾林堿對RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表達的影響

防己諾林堿對RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1基因表達的影響如圖3所示。潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨組織中BMP2的水平較對照組顯著降低(P<0.01)。與對照組相比，潑尼松龍組股骨組織中ATG-5、RUNX-2和Beclin-1的基因表達顯著降低并且RANKL的表達顯著增強(P<0.01)。然而，與潑尼松龍組相比，用防己諾林堿治療的C、D和E組顯著增強了ATG-5、RUNX-2、Beclin-1和BMP2的基因表達，并且股骨組織中RANKL的表達顯著降低(P<0.01)；且上述療效以劑量依賴的方式出現。

圖3 防己諾林堿對潑尼松龍所致骨質疏松大鼠股骨組織RANKL、ATG-5、RUNX-2、Beclin-1、BMP2基因表達的影響 A：對照組;B：潑尼松龍治療組;C：防己諾林堿低劑量組;D：防己諾林堿中劑量組;E：防己諾林堿高劑量組。注：與對照組相比，#P<0.01; 與潑尼松龍組相比，*P<0.05，*P<0.01。Fig.3 Assessment of the effect of fangchinoline on gene expression of RANKL, ATG-5, RUNX-2, Beclin-1 and BMP2 in the femur tissues of prednisolone-induced osteoporosis rat model

3 討論

之前的一項研究[12]表明，潑尼松龍誘導的骨質疏松癥是一種成熟的骨質疏松癥大鼠模型，因為血清中的生化參數水平發生了改變，BMD降低。本次研究結果表明防己諾林堿治療顯著減弱了血清中生化參數的改變水平，并且還改善了潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨BMD。據報道[13]，潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠中，骨的微結構也發生了改變，從而降低了骨強度。使用防己諾林堿治療會影響潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨干骺端中微觀結構的改變。

文獻[14]顯示，成骨細胞分泌BMP2，調節成骨細胞的礦化和增殖。 此外據報道[15]，通過RANK的表達和RUNX-2的表達激活破骨細胞，與骨質疏松癥有關。本次研究表明，使用防己諾林堿治療可以劑量依賴性地減弱潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨干骺端骨組織中BMP-2、RANKL和RUNX-2蛋白的表達。自噬也是骨質疏松癥發展的機制之一，據報道[16]，一些蛋白質如ATG-5和Beclin-1是自噬體的調節蛋白，并且使用防己諾林堿治療改變了這幾種蛋白質的水平，如ATG-5和Beclin-1，以劑量依賴的方式在潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠股骨組織中表達。

綜上，防己諾林堿可通過誘導自噬來抑制成骨細胞的凋亡并防止潑尼松龍誘導的骨質疏松癥大鼠骨質流失，其對骨質疏松癥具有很強的活性，可能是一種很有意義的臨床研究分子。