我國創制農藥生物測定概述與展望

陳 杰*，袁 靜，許勇華

(1.浙江農林大學 浙江省綠色農藥2011協同創新中心，杭州311300；2.浙江省化工研究院有限公司，杭州310023)

農業生產中，各種農作物病、蟲、草害的頻繁發生帶來了巨大的損失，嚴重威脅糧食產量和品質。有害生物化學防治是現代農業生產實踐中保證農作物高產、穩產和品質的重要手段。根據世界糧農組織(FAO)評估，通過使用農藥進行有效的防治，可挽回全世界農作物總產量30%～40%的損失。諾貝爾獎獲得者、小麥育種學家Noman K.Borlang曾經說：“沒有農藥，人類將面臨饑餓的危險”。農藥是農業必需投入品，在近百年的歷程中，農藥新品種不斷問世，至今已經有681個有效成分，應用于市場的登記產品有4萬多。農藥創制是一項高投入、高風險、高回報的長期項目，新農藥品種必須同時滿足“高效、安全、經濟”的要求。據Phillips McDougall公司統計，成功上市1個新農藥品種，平均需要篩選16萬個化合物，耗資約3億美元，耗時12年[1]。作為農藥研發流程中被譽為“眼睛”和“航標”之稱的生物活性測定[簡稱生物測定(bioassay)]，貫穿于新化合物結構設計優化、活性發現、前期研究、開發登記、生產應用到產品生命周期管理(圖1)。隨著具有新作用機制的農藥新品種的不斷問世、新合成方法的產生、外來有害生物的入侵、抗藥性有害生物的發生以及新型助劑在農藥制劑研發中的應用，生物測定技術水平亟需發展。筆者根據多年的工作經驗，概述了我國新農藥研發中生物測定的主要內容和現狀，并展望其發展趨勢。

圖1 創制農藥研究與開發評估流程及閘門

1 農藥生物測定研究內容及作用

農藥生物測定(pesticide bioassay)是指運用特定的試驗設計，利用生物整體或離體的組織、細胞或酶等靶標對農藥的反應，并以生物統計為工具統計分析測試對象在一定條件下的效應，評價某種作用物的生物活性[2]。農藥生測現在已發展成為集昆蟲學、植物病理學、微生物學、植物學、雜草學、有機化學、分子生物學、信息學和統計學等多學科于一體的綜合技術，是農藥科技創新工程中不可或缺的關鍵技術。農藥生測技術水平決定著新農藥創制研發的進程和質量。新農藥的開發必須依賴生物活性測定所獲得的各項結果和信息，以此評價其商品化價值。生物測定是以標準化的靶標生物和試驗方法，測定作用物的生物活性、安全性、作用特性、作用方式和應用范圍，明確藥劑特性和市場應用前景。其研究內容：⑴ 創制研究階段生物測定，包括新化合物生物活性篩選，結構與活性構效關系研究，發現新的作用機制，高活性化合物深入篩選研究和田間小區藥效篩選試驗等；⑵ 創制開發階段即產品登記和市場應用階段生物測定，包括農藥組合物復配配方篩選和聯合毒力測定研究，候選物的區域性多點多靶標田間應用技術研究，農藥登記田間藥效試驗、示范推廣試驗和抗性風險及其機理研究等；⑶ 產業化階段生物測定，包括擴大使用范圍，劑型和組合物開發，抗性監測與管理等。

1.1 創制研究階段生物測定

通過標準的試驗方法，以模式化的菌、蟲、草為測試靶標，按照規范的篩選流程，對大量的新物質樣品(化合物或提取物)進行農藥生物活性篩選。主要目的是發現活性，確證活性大小、溫室效果和作用特性等，初步確定應用范圍和防治對象等，發現新作用方式，提供QSAR數據等。

1.1.1 普篩、初篩和復篩研究

普篩：單一劑量試驗，以菌、蟲、草模式靶標生物為測試對象，明確新化合物是否具有農藥生物活性。

初篩：設置 3～5個劑量(濃度)試驗，以普篩有活性的靶標為測試對象，確證樣品生物活性，通過活性比較明確構效關系。

復篩：設置5～7個劑量的毒力測定試驗，擴大試驗靶標范圍，明確對敏感作用對象的活性(EC50/90、ED50/90或LC50/90)、防治譜和對作物的安全性，初步評價其潛在的成藥性；對于除草活性化合物，需要求出其對安全性高的作物的 ED10[3]，對于殺蟲或殺菌活性化合物，需要測定對應用對象的安全性，并與商品化藥劑進行比較，以評價是否可進行田間小區藥效驗證篩選試驗。

田間小區驗證篩選：復篩后的進篩化合物，在季節適合的條件下盡快開展田間藥效試驗，在田間自然生態環境條件下，對獲得的靶標溫室效果和作物安全性結果進行確認，為進一步的研究提供依據。

1.1.2 深入篩選/田間小區驗證篩選研究

主要開展目標物的作用譜、作用特性、作物安全性以及田間小區藥效試驗等研究，明確化合物的作用特點、防治對象、目標市場和使用技術等，篩選出具有一定應用前景的高活性候選物。

深入篩選：在溫室條件下，開展作用方式(芽前/芽后、內吸/胃毒/觸殺/熏蒸、保護/治療等)、作用特性(吸收傳導性、抗雨水沖刷性、持效/殘效等) 和使用技術(施藥適期、施藥方式、使用劑量及環境影響因子)等研究，明確活性化合物的應用前景，為進一步的開發研究提供科學依據。

田間小區藥效驗證試驗：在田間自然環境生態條件下，對篩選出的高活性化合物進行藥效和安全性確認，以便開展進一步研究。

通過深入篩選和田間驗證試驗評價后的化合物為具有一定成藥性的高活性候選物，繼續開展相關研究。

1.1.3 高活性候選物篩選研究

主要開展高活性候選物在不同生態環境條件下，區域性多點的田間小區藥效試驗和使用技術研究，同時開展公斤級小試工藝、制劑研究和短期的健康和環境安全性評價等，綜合評估其成藥性。生測的主要研究內容：⑴ 通過靶標適合區域多點田間藥效試驗，初步確認施藥方式/方法、施藥適期、使用劑量及施藥次數，明確施藥間隔期、氣候條件對施藥的影響，以及對其他非靶標生物和后茬作物的影響等，初步確定其市場應用范圍和準入點；⑵ 開展制劑配方的活性篩選，確定最佳穩定制劑產品，進行產品登記；⑶ 開展候選物與常規農藥的混配聯合毒力測定，為后續市場開發提供依據。

對高活性候選物及其制劑綜合評估后進行登記開發，該階段生測結果是決定其能否進入登記開發的關鍵要素。

1.2 創制開發階段生物測定

開展候選物中試產品的使用技術研究，主要研究內容：⑴ 繼續開展靶標適合區域多點田間藥效試驗，進一步確認施藥方式/方法、施藥適期、使用劑量、施藥次數及抗性風險預測，明確施藥間隔期、氣候條件對施藥的影響，以及對其他非靶標生物和后茬作物的影響等；⑵ 繼續開展新制劑生物活性測定和組合物配方篩選，定位新靶標、新用途，提高產品性能；⑶ 通過開展靶標適合區域應用推廣示范試驗，助力其市場開發進程。

此階段的田間藥效試驗和應用技術研究是決定農藥產品登記和未來市場價值評估的關鍵。對區域性的試驗數據進行系統總結，明確其市場應用推廣技術要點及注意事項等，指導新產品的正確使用和合理布局；研究結果既是進行農藥風險評估及風險管理決策的基礎，也是進行農藥登記殘留試驗中制定農藥最大殘留限量標準的基礎；同時還明確藥劑對作物及非靶標有益生物的影響，保證了環境生態安全。

同時通過對新制劑和組合物的生測篩選，有利于進一步擴大產品市場占有率，提高產品的市場競爭力。

1.3 產業化階段生物測定

如何延長新產品在市場上的生命周期，使其有更長壽命，獲得最大的經濟效益，是該階段生測技術研究的重點目標。

1.3.1 混配產品研發是延長產品壽命的基本手段

通過對前期的大量試驗數據總結，掌握新產品特點，挖掘其自身潛力，結合農業生產中病、蟲、草害發生情況和市場產品動態，開發混配制劑產品，擴大防治譜和使用范圍，以提高產品市場占有率和競爭力。同時根據防治對象發生規律，研究新的使用方法，制定新的防治措施，如甲維鹽[methylamino abamectin benzoate (salt)]作為廣譜殺蟲劑，普遍采用噴霧方法施用，但噴霧施用難以有效防治松材線蟲病，而采用注干方法，防效達80%以上[4]。

1.3.2 抗性監測管理是延長產品壽命的重要手段

長期頻繁使用某一種農藥品種導致有害生物產生抗性。植物病、蟲、草產生抗藥性以后，再用這種藥劑防治時，不僅藥劑使用濃度、使用次數增加及防治費用成倍提高，而且還會加重農藥對環境的污染和對有益生物的危害，縮短產品生命周期。為了延緩抗藥性產生，通過農藥抗性監測，進行抗性風險評估，制定抗性治理策略，也是農藥生物測定的重要工作之一。不同作用機制的產品混配使用是抗性治理的措施之一，如氟環唑和吡唑醚菌酯混配，延緩了后者的抗性產生，延長了產品的使用壽命。

1.3.3 利用新技術和新理論延長產品生命周期

新農藥研發具有周期長、投入多、風險高和回報高的特點，延長產品使用壽命是提高回報的重要途徑。隨著產品在農業生產中的頻繁、長期使用，以及不斷擴大的應用市場，需要新技術、新理論等手段解決藥效減弱和環境安全等問題，以延長其生命周期。如草甘膦(glyphosate)的應用持續增長得益于孟山都公司轉基因技術；汽巴-嘉基公司提出抗病激活劑(plant activator)理論；日本明治制果株式會社將烯丙苯噻唑(probenazole)應用于水稻育苗[5]，2011年銷售額達到1.20億美元，成為全球最大的抗病激活劑；巴斯夫公司開發的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑吡唑醚菌酯(pyraclostrobin)，為了解決因其對水生生物的毒性而限制在水稻上的應用問題，公司開展大量的篩選研究，開發的新微囊懸浮劑配方中使用專利微膠囊技術，確保霧滴在水稻葉片上迅速釋放，對病害產生最佳的預防和防治效果，而少量落入稻田水中的微膠囊迅速沉入底泥避免其對魚類的暴露。研究中需要對微囊懸浮技術配方的每個參數進行大量的測試以確定其生物防效及其對水生生物的毒性潛力。此外，在田間推廣試驗中發現該藥劑的促生作用后，研究發現該藥劑作用機制獨特，保健增產效果明顯，成為全球第一個以“植物健康作用”登記的殺菌劑。當然這些新技術、新產品研發的關鍵環節需要研究新的生測技術給予相應評價。

2 我國創制農藥生物測定研究進展

我國農藥產業經過70年的發展，發生了翻天覆地的變化，目前我國已經成為農藥生產大國和全球最大的農藥出口國。2017年，農藥產量已超過300萬t，出口量超過150萬t。我國農藥經歷了仿制為主、仿中有創、仿創結合、創制為主、自主創新的歷程。20世紀 50年代后期，中國科學院上海有機化學研究所合成了乙基大蒜素(ethyl allicin)[6]，60年代沈陽化工研究院試制成功除草醚(nithophen)，從新中國第一個創制農藥產品多菌靈(carbendazim)[7,8]，到我國首個獲得中、美、歐等多國發明專利的創制農藥品種氟嗎啉(flumorph)[8,9]，創制農藥品種陸續問世，到目前為止創制的農藥品種有50多個。農藥生物測定在農藥研究中發揮著重大作用，近20年來，隨著具有中國特色農藥研發體系的形成和穩步發展，農藥生物測定技術逐步完善，形成越來越科學的評價體系。

2.1 室內生物測定技術標準化

室內生測技術是研究作用物、靶標生物和反應強度三者關系的一項專門技術，是測定被試物在一定的環境條件下對試驗靶標的作用。該技術對供試靶標生物、測試的環境條件、試驗設計及結果分析等均提出了嚴格的要求。其首要條件就是培養標準化靶標生物，靶標生物的生理狀態不同對作用物具有不同的反應，為了保證測定結果準確可靠，供試生物要有足夠數量和良好質量。從20世紀90年代開始，政府和企業十分重視農藥技術領域創新體系建設，加大研發投入，其關鍵的生測技術研究和體系建設得以快速發展。多家實驗室建立了環境條件可控的養蟲室、植物培養室、人工氣候室和溫室，規范了農業生產中發生的、具有代表性的有害昆蟲、病原菌、雜草和衛生倉儲害蟲等靶標的培養方法，如小菜蛾[Plutella xylostella(Linnaeus)]、黏蟲[Mythimna separata(Walker)]、苜蓿蚜(Aphis craccivoraKoch)、水稻褐飛虱[Nilaparvata lugens(Stal)]和朱砂葉螨(Tetranychus cinnabarinusBoiduval)等已經成為新藥篩選的模式靶標。此外，農業重要害蟲棉鈴蟲[Helicoverpa armigera(Hübner)]、甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]和斜紋夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]、桃蚜[Myzus persicae(Sulzer)]和西花薊馬[Frankliniella occidentalis(Pergande)]等均已實現常年累代飼養[10]。建立了殺菌劑生測靶標黃瓜霜霉病菌[Pseudoperonospora cubensis(Berk.et Curt.)Rostov.]、黃瓜白粉病菌(Erysiphe cichoracearumDC)和水稻紋枯病菌[Thanatephorus Cucumeris(Frank) Donk]等45種病原菌保存和培養方法[11]，并能保存和培養稗草[Echinochloa crusgalli(L.) Beauv]、牛筋草[Eleusine indica(L.) Gaertn.]和反枝莧(Amaranthus retroflexusL.)等70多種農田重要的禾本科、闊葉和莎草科雜草[12]。建立了規范的殺蟲劑毒力測定方法50多種[10]，殺菌劑活體盆栽法20多種[11]，除草劑室內生測方法30 多種[12]。

為了保證試驗方法的一致性，國家農業農村部從2006年開始，陸續發布行業標準《農藥室內生物測定試驗準則》《農藥對作物安全性評價準則》《農藥抗性風險評估》，對殺蟲劑、殺菌劑、除草劑以及植物生長調節劑的室內生物活性、作物安全性、抗性風險評估試驗方法進行了規范和統一。目前建立了《農藥室內生物測定試驗準則》行業標準殺蟲劑14個(NY/T1154.1～14-2006)[13]、除草劑 11個(NY/T 1155.1～11-2006)[14]、殺菌劑 19 個(NY/T 1156.1～19-2006)[15]，建立農藥對作物安全性評價行業標準3個[16]，建立農藥抗性風險評估行業標準12個[17-19]。行業標準從試驗靶標、儀器設備、試材準備、藥劑配制、試驗處理、試驗調查、數據統計與分析等方面對農藥室內生物測定進行了全面的規范，目前已成為我國開展農藥室內生物測定試驗的主要依據。

2.2 田間藥效試驗管理規范化

農藥田間藥效試驗主要內容：⑴ 明確防治效果及應用技術試驗，如農藥新品種、新劑型的篩選試驗，農藥產品(包括不同制劑、復配制劑、農藥混用等)之間效果比較試驗，對有害生物的防治適期、最佳劑量和最佳施用次數的研究試驗，不同使用方式及環境與耕作栽培條件對藥效的影響試驗等。⑵ 農藥對試驗作物的影響試驗，如農藥對作物安全性、產量、品質和抗逆性等的影響。⑶ 農藥對鄰近作物及天敵的影響試驗，如農藥對試驗區域鄰近作物的影響，主要是對天敵等非靶標生物的影響。

田間藥效試驗結果是進行農藥產品市場應用價值評估、殘留或其他登記試驗劑量設置、市場經濟效益分析、產品生命周期管理的關鍵數據。為了保證結果真實、準確、可溯源，田間藥效試驗質量規范管理非常重要。1985年FAO發布了《農藥登記藥效資料要求》，2002年FAO重新修訂《農藥銷售和使用行為國際準則》對藥效試驗提出了相應要求，2006年 FAO制定《農藥登記藥效評審準則》[20]，要求藥效試驗遵循良好試驗操作(Good Experimental Practice，GEP)。此外，1992 年 EPPO 發布“Standards for efficacy evaluation of plant protection products”，之后于1996年、2003年和2012年進行了修訂。FAO和EPPO都對田間藥效試驗單位及人員、試驗藥劑、施藥器械和條件、試驗方案、試驗程序、原始記錄和結果分析等做了規范性要求，同時必須建立試驗標準化操作規程(SOP)。

我國田間藥效試驗的規范和管理也在持續進行，先于2000年頒布《農藥田間藥效試驗準則(一)》[21]，后于2004年頒布《農藥田間藥效試驗準則(二)》[22]，制定了上百項農藥登記田間藥效試驗準則，并陸續發布行業標準，指導登記農藥田間藥效試驗技術。同時相繼出臺管理辦法，如《農藥登記藥效試驗認證管理辦法》《農藥登記田間藥效試驗報告編寫要求》等，逐步要求試驗單位遵循GEP。2014年，農業農村部農藥檢定所依據GEP要求，組織行業專家著手起草，并多次組織討論“農藥登記田間藥效試驗規范”，于2016年5月23日發布《NY/T 2885-2016農藥登記田間藥效試驗質量管理規范》[23]。2017年2月8日，國務院通過新的《農藥管理條例》，條例自2017年6月1日起施行。在此背景下，農業農村部發布2570號公告《農藥登記試驗質量管理規范》，加強并規范了包括田間藥效試驗在內的農藥登記試驗管理，確保了農藥登記試驗數據的完整性、可溯源和真實性。至此，我國農藥藥效試驗管理與國際接軌。截止2020年2月5日，已經有81家試驗機構獲得符合《農藥登記試驗質量管理規范》的田間藥效試驗資質。

2.3 生物測定在新農藥研發中逐漸成熟

我國農藥生物測定起于20世紀60年代并逐步發展，在“九五”“十五”期間，形成以沈陽化工研究院、南開大學為依托單位的國家北方農藥創制中心和以浙江省化工研究院、江蘇省農藥研究所、湖南化工研究院、上海農藥研究所為依托單位的國家南方農藥創制中心。同時，一些高等學校、科研院所及農藥企業也建立了農藥創新研究中心。科技部通過科技攻關計劃，支持農藥新品種創制研究、生測技術研究、創制農藥生物活性篩選標準操作規程(SOP)體系建設研究，使我國農藥生物測定技術和方法立足實際需求，本著“邊建設邊運行邊出成果”的原則，建立了規范、系統、可行的農藥生物活性篩選評價體系及操作規程。“十一五”“十二五”期間，國家科技支撐計劃繼續支持農藥新品種創制和生物測定技術研究，通過生物測定技術研究課題，新增和規范了病、蟲、草重要測試靶標的室內培養和生測篩選技術，開發了基于分子生物學的高通量篩選方法和微量快速篩選技術，對病、蟲、草抗性靶標進行了抗性突變和機理研究，并將抗性靶標應用于反抗性農藥篩選。在遼寧、浙江和湖南等地建立了規范化的田間試驗示范基地，規范和完善了農藥生物活性篩選技術體系。一些新靶標、新方法已經應用于新農藥研究，提高了農藥的創新能力和開發效率。經過多年的研究和實踐積累，我國的生測技術取得突破性進展。

目前新化合物合成能力已達到3萬個/年，生測篩選能力達到6萬個/年[24]。篩選出我國具有自主知識產權的新農藥品種近50個，其中四氯蟲酰胺、氰烯菌酯、噻唑鋅和喹草酮等新產品已經在農業生產中發揮著重要作用，還在開發過程中的新產品即將閃亮登場。

2.4 新農藥登記管理中抗性風險評估備受重視

新農藥使用2～20年，一些主要有害生物即出現抗性，全世界至少有600種害蟲及害螨對一種或多種殺蟲劑產生了抗性，其中小菜蛾、棉蚜和溫室白粉虱等已對常用殺蟲劑產生了較高的抗性水平[25]；從1992年至今，我國已有 44例抗性雜草報道，其中稗草、雨久花、日本看麥娘和播娘蒿等雜草抗性發展嚴重[26-28]；植物病原菌抗性更是不斷發展，灰霉病菌、霜霉病菌及白粉病菌等已對多種藥劑產生了不同程度的抗性[29]。吡蟲啉是用于防治褐飛虱的第一個商品化新煙堿類藥劑，邵振潤等對多地稻飛虱進行檢測，發現褐飛虱對其產生了嚴重的抗藥性[30]。我國學者在監測水稻褐飛虱、白背飛虱對吡蟲啉等煙堿類抗性的同時，對其交互抗性和抗性機制等均進行了研究[31-34]。

為了延緩有害生物抗藥性的發展，需對農藥的抗性風險進行評估和管理。1999年EPPO首次發布EPPO Efficacy evaluation of plant protection products——PP 1/213 (4) Resistance risk analysis，并分別于2002、2012和2015對其進行修訂完善[35]。歐盟 (歐共體) 也早在2009年統一要求申請者在藥物登記的過程中提供可能出現和抗性發生有關的信息。我國于2010年頒布了《農藥抗性風險評估總則》，隨后出臺了 12條行業標準[17-19]，規范了抗藥性評估方法。要求在登記新農藥和涉及新使用范圍的化學農藥時，原則上應提供抗性風險評估資料。按殺蟲劑、殺菌劑、除草劑分別建立應開展抗性風險評估的靶標生物和化合物清單，實行分類管理。

3 展 望

我國新農藥創制起步較晚，“九五”期間在國家的大力支持下，建立了南北方6個農藥創制研究基地生測中心，開啟了為創制農藥測定生物活性的研究之路。經過20余年的發展，從設施、設備到測試靶標、方法、活性評價標準和篩選模式等建立了基本符合我國農藥生物活性篩選的平臺，也組建了專業配套的研究隊伍。近10年來，國內數家農藥企業相繼組建了農藥生測研究團隊，生物測定技術取得較大的進展。但是我國農藥企業總體上在生測方面缺乏先進技術和設施，對生測的研發重視程度不夠，人力和財力投入不足，與國際農藥公司相比差距仍然很大。生測技術的適用性、先進性和系統性已成為制約我國綠色生態農藥品種研發的瓶頸因素。

農藥生物測定是一門重要的實用和實踐科學，其研究內容隨著農藥的發展不斷得到加強和豐富。農藥研發定位慣以市場為導向，農業生產中發生的危害嚴重的病、蟲、草就是新農藥產品研發的市場所在。近年來，隨著土地流轉，農藥不科學的頻繁使用，農產品結構和耕作制度的改變，加之自然氣候、環境條件變化，導致病、蟲、草種群及其敏感性隨之變化，抗藥性持續加劇和低效藥劑等問題突出，如稻飛虱、小菜蛾、白粉病、灰霉病、稗草和播娘蒿等有害生物的抗藥性呈指數增長。2012-2016年對水稻褐飛虱田間種群抗藥性監測結果顯示，其對吡蟲啉抗藥性達132.0～8 478.0倍[36]。急需高效、低毒、無殘留的農藥新產品、新劑型產品投入市場。因此，需要研究和發展重要標準化的生測靶標、科學的試驗方法和評價體系等技術。

近些年來，隨著基因編輯、結構生物學、化學生物學和大數據智能化等技術發展，并向農藥創新領域的滲透，催生了RNA干擾和免疫激活蛋白等全新機制農藥。如孟山都公司開發出阻止害蟲或病原基因表達、防治玉米蟲害和病害的 RNA噴劑BioDirect；昆士蘭大學研發出通過修飾植物基因表達提高抗病毒能力的 RNA噴霧農藥 BioClay(LDH-dsRNA)。目前我國尚缺乏這些全新機制農藥的生測技術。

總之，作為“眼睛”的發現新農藥的生物測定技術面臨極大的挑戰。未來，隨著人工智能、分子生物學、遺傳工程技術、遙感定位系統和信息智能化的飛速發展，以及化學農藥分子設計與作用機制研究的不斷深入，相信越來越多先進的生測新方法、新技術將不斷應用于我國綠色農藥創新研究中，為綠色創制農藥發現和科學使用提供關鍵支撐，為農產品提質增產保駕護航。