QuEChERS-超高效液相色譜串聯質譜法同時測定大米、小麥和動物源食品中異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆殘留

戴高臣 吳小虎 張盈 崔凱 董豐收 劉新剛 徐軍 鄭永權 秦樊鑫

摘要 本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）同時測定異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆在大米、小麥、牛肉、牛奶、雞肉和雞蛋的殘留檢測方法。樣品經2%甲酸乙腈提取，以N-丙基乙二胺（PSA）凈化，利用乙腈和0.2%甲酸水作為流動相梯度洗脫，T3色譜柱分離，在多反應監測模式下定量分析，基質外標法定量。結果表明：異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆溶劑標準曲線和基質標準曲線在1～1 000 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.99。在4個加標水平下，異丙隆日內平均回收率為74.0%～107.0%，相對標準偏差0.7%～12.9%;日間平均回收率為76.2%～108.7%，相對標準偏差1.1%～19.8%。脫甲基異丙隆日內平均回收率為76.9%～113.5%，相對標準偏差0.6%～13.9%;日間平均回收率為77.7%～107.4%，相對標準偏差2.2%～17.4%。異丙隆和脫甲基異丙隆的定量限均為1.0 μg/kg。該方法簡便、快捷、準確、靈敏度高，適用于異丙隆和脫甲基異丙隆在大米、小麥、牛肉、牛奶、雞肉和雞蛋6種基質中殘留的檢測，為解決異丙隆和脫甲基異丙隆在食品中殘留的安全問題提供技術方法。

關鍵詞 QuEChERS; 超高效液相色譜串聯質譜法; 異丙隆和脫甲基異丙隆; 食品

中圖分類號： S 481.8

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019479

Simultaneous determination of isoproturon and its metabolite

desmethyl-isoproturon in rice， wheat and animal foods by

QuEChERS-UHPLC-MS/MS

DAI Gaochen1，2， WU Xiaohu2， ZHANG Ying2， CUI Kai2， DONG Fengshou2，

LIU Xingang2， XU Jun2， ZHENG Yongquan2， QIN Fanxin1

（1. Key Laboratory for Information System of Mountainous Areas and Protection of Ecological Environment

of Guizhou Province， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China; 2. State Key Laboratory for

Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of

Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

A method for the simultaneous determination of isoproturon and its metabolite （desmethyl-isoproturon） in rice， wheat， beef， milk， chicken and egg samples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UHPLC-MS/MS） was established. The experimental samples were extracted with 10 mL acetonitrile containing 2% formic acid and purified by matrix dispersion extraction with 50 mg PSA as adsorbent. The mobile phase was eluted with acetonitrile and 0.2% formic acid aqueous solution. The analytes were separated on an ACQUITY UPLC HSS T3 column （2.1 mm×100 mm， 1.8 μm） and quantitatively analyzed by the external standard method using matrix-matched calibration curves. The results showed that the linear relationships between isoproturon and its metabolite desmethyl-isoproturon were good in the range of 1 to 1 000 μg/L， with the correlation coefficients all higher than 0.99. At four spiked levels， the intra-day average recoveries of isoproturon were 74.0%-107.0% （RSD 0.7%-12.9%）， the inter-day average recoveries were 76.2%-108.7% （RSD 1.1%-19.8%）， respectively. The intra-day average recoveries of desmethyl-isoproturon were 76.9%-113.5% （RSD 0.6%-13.9%）， the inter-day average recoveries were 77.7%-107.4% （RSD 2.2%-17.4%）， respectively. The limits of quantification （LOQs） were 1.0 μg/kg for isoproturon and desmethyl-isoproturon. The developed method is convenient， rapid， accurate and reliable， which could be applied for the simultaneous detection of isoproturon and desmethyl-isoproturon in rice， wheat， beef， milk， chicken and egg. It was of great significance to solve the safety problems for the residue of isoproturon and desmethyl-isoproturon in foods.

Key words

QuEChERS; UHPLC-MS/MS; isoproturon and desmethyl-isoproturon; foods

異丙隆（isoproturon），3-（4-異丙基苯基）1，1-二甲基脲，是一種取代脲類選擇性除草劑[12]，是我國應用最廣、施用量最大的麥田除草劑之一，可用于小麥、棉花、花生、玉米、水稻、豆類作物，能夠有效控制一年生禾本科雜草和闊葉雜草[34]。該藥通過根部或者葉部進入靶標植物中，阻斷光合作用系統Ⅱ中的電子傳遞，從而殺死雜草[5]。

異丙隆在土壤中的殘效期較長，甚至可達一年以上[4]。歐洲食品安全局（EFSA）的報告顯示，異丙隆的殘留檢測主要集中于小麥和大米等谷物類產品。異丙隆為二類致癌物質，對大鼠、狗和猴子等哺乳類動物的肝臟有毒性，并且會對哺乳動物的內分泌系統造成影響。異丙隆會在土壤和地下水環境中通過去甲基化反應生成代謝物脫甲基異丙隆（desmethyl-isoproturon），脫甲基異丙隆具有較高的土壤遷移率和較高的致癌風險，同時對大鼠有中等急性毒性，會導致物種染色體畸變以及可能會導致基因突變[6]。在我國食品國家安全標準中，異丙隆在糙米和小麥中的殘留最大限量為0.05 mg/kg。隨著防草除害的需要，異丙隆的使用量不斷增加。異丙隆存在于土壤、水環境以及小麥、水稻等相關作物中，并且由于去甲基化反應的發生，會生成其代謝物脫甲基異丙隆，在小麥、水稻等相關谷物類作物中殘留[56]。這兩種化合物通過食物鏈在牛肉、雞肉等動物產品中也會有殘留，進而可能對人類健康產生潛在的風險。因此，建立一種適用于同時快速檢測小麥、水稻作物以及牛肉、雞肉等動物制品中異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆的測定方法對保障作物安全生產及人類健康具有重要意義。

目前，異丙隆的檢測方法主要有氣相色譜質譜法（GC/MS）[78]和高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[912]等，前處理方法主要有固相萃取法（SPE）[7]、基質固相分散法[9]和索氏提取固相萃取法[11]等，主要檢測基質為小麥、土壤和水體;異丙隆代謝物脫甲基異丙隆的檢測方法主要為高效液相色譜串聯質譜法（HPLC-MS/MS）[1317]，前處理方法主要有QuEChERS[14]法，固相萃取法（SPE）[15]等，主要檢測基質為大米、土壤和水體。其中，UHPLC-MS/MS技術結合QuEChERS前處理方法操作簡單，分析時間少，具有高靈敏度和高準確性等優點，已成為異丙隆殘留分析的重要手段。

當前大多數研究主要關注于異丙隆母體，對代謝物關注較少，且檢測基質單一，對異丙隆的檢測集中于土壤、水體、小麥和糙米基質，基質成分簡單，對動物源等復雜基質的檢測較少。而同時檢測多種基質中異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆的方法尚未見報道。本研究建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同時測定大米、小麥和4種動物源食品中異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆的檢測方法。該方法簡便、快捷、靈敏度高，為不同食品基質中異丙隆及脫甲基異丙隆殘留監控和質量安全評價提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

異丙隆（98.9%）標準品購于北京勤誠亦信科技開發有限公司;脫甲基異丙隆（98.0%）標準品購于上海倍卓生物科技有限公司;色譜純乙腈，德國默克公司;分析純乙腈，中國國藥集團化學試劑有限公司;超純水，Milli-Q 美國MILLIPORE公司;甲酸（色譜純），中國上海阿拉丁生化科技有限公司;N-丙基乙二胺（PSA），美國Agela Technologies公司。超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS，Acquity-TQD），美國Waters公司;Acquity UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm， 1.8 μm），美國Waters公司;CK2000高通量組織研磨儀，美國Thmorgan公司;TG16-WS臺式快速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;FW 100高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司;Filter unit濾膜（0.22 μm），Agela Technologies公司。

1.2 樣品前處理

小麥和大米空白樣品研磨成粉狀，雞肉和牛肉空白樣品打碎成泥狀。準確稱取小麥、大米、雞肉、牛肉、雞蛋和牛奶樣品各10.0 g（±0.1 g）于50 mL離心管中（其中小麥、大米、雞肉、牛肉樣品補5 mL超純水），隨后加入10 mL 2%甲酸乙腈，振蕩3 min。加入1.5 g NaCl和4 g無水MgSO4，振蕩3 min后在5 000 r/min下離心5 min。取上清液1.5 mL置于裝有50 mg PSA和150 mg無水MgSO4的2 mL離心管中，渦旋1 min，4 000 r/min下離心5 min，取上清液過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3 標準溶劑的配制及標準曲線的繪制

稱取異丙隆標準品（0.010 11±0.000 01）g，脫甲基異丙隆標準品（0.010 20±0.000 01）g，以色譜純乙腈為溶劑分別配制成100 mg/L的儲備液100 mL，于4℃冰箱中保存。分別準確移取適量的異丙隆和脫甲基異丙隆標準儲備液，用色譜純乙腈逐階稀釋成濃度為1 000、500、100、50、10、5、1 μg/L的系列混合標準溶液，按照預定的儀器條件測定，以質量濃度X（mg/L）為橫坐標，相應的色譜峰面積Y為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;柱溫：45℃;流速0.3 mL/min;進樣體積：5 μL;以乙腈和含體積分數0.2%（V/V）甲酸的水溶液為流動相進行梯度洗脫，洗脫條件見表1。

1.4.2 質譜條件

采用超高效液相色譜串聯質譜，三重四級桿檢測器測定。離子源為電噴霧離子源，多反應監測（MRM）正離子模式（ESI+）;所用氣體均為高純氮氣;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度120℃;去溶劑溫度350℃;去溶劑氣流量500 L/h;錐孔反吹氣流量50 L/h。使用儀器對異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆的ESI和MS進行分析優化，結果如表2所示。

1.5 基質效應的計算

基質效應的強弱與基質種類有關，同時還受農藥結構、濃度等理化性質的影響，如一些含有氨基、羥基和氨基甲酸酯基等官能團的農藥極易吸附在檢測器進樣口的活性位點上，導致樣品基質效應變化[1718]。除此之外，檢測器和進樣方式等也會對基質效應產生影響。

基質效應（Me）=（基質標準曲線斜率/溶劑標準曲線斜率-1）×100%。

Me=0，表示不存在基質效應;Me在-20%～20%時為弱基質效應;當 Me在-50%～-20%或20%～50% 時為中等基質效應;當Me≤-50%或>50%時為強基質效應[19]。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇

在文獻[1619]基礎上，分別考察了甲醇水體系和乙腈0.2%甲酸水體系作為流動相時的洗脫效果。結果表明，使用甲醇水體系作為流動相時峰型不對稱且峰型寬大，而乙腈0.2%甲酸水體系作為流動相時則顯示出較好的峰型，且無雜質峰干擾，故選其作為流動相，并調整流動相的比例和流速以控制異丙隆及脫甲基異丙隆的保留時間。異丙隆和脫甲基異丙隆在該流動相洗脫梯度下峰型良好，色譜圖如圖1所示。

2.2 前處理方法的選擇

2.2.1 前處理方法的優化

在QuEChERS方法中，基礎的提取溶劑為乙腈[20]，乙腈有著優良的溶劑性能，能溶解多種有機、無機和氣體物質。隨著QuEChERS方法的不斷改進和完善，在各種研究中實驗人員會嘗試在乙腈中加入不同比例的試劑，如甲酸等，以取得更好的回收率和更低的基質效應[21]。C18可以從極性樣品中提取非極性和中極性化合物，主要用于反相萃取;PSA主要去除非極性樣品中有機酸、色素、糖類和脂肪，主要用于正相萃取;florisil可以從非極性溶液中萃取極性化合物，主要吸附極性雜質和脂肪酸，以及從非水溶液中吸附低極性以及中等極性化合物;MWCNTs具有較大的比表面積、穩定的化學性質和較強的吸附能力等優點，且對色素有著明顯的凈化效果，近年來被作為一種新型吸附材料廣泛應用于農藥殘留提取[2224]。大米和小麥主要成分為淀粉和蛋白質，牛肉、牛奶、雞肉和雞蛋，基質復雜，富含脂肪、蛋白質和一些其他親脂性化合物，這些化合物很容易與目標分析物共同提取。因此，合適的提取溶劑和凈化劑對目標組分的準確提取非常重要。

本研究中考察了乙腈、1%甲酸乙腈和2%甲酸乙腈作為提取劑，PSA、florisil、C18和MWCNTs作為凈化劑時異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆在6種食品基質中的回收率。結果如圖2所示，在大米、小麥、牛肉、牛奶、雞肉、雞蛋6種基質的空白樣品中，在10 μg/kg添加水平下，異丙隆和脫甲基異丙隆只有在雞肉-2%甲酸乙腈-florisil組合下添加平均回收率分別為156%和143%，超過NY788-2016標準中所允許的回收率范圍（70%～120%）[25]。而在剩余基質和提取條件下，異丙隆在不同基質中的平均回收率為72%～118%，相對標準偏差（RSD）為0.56%～15.97%;脫甲基異丙隆在不同基質中的平均回收率為72%～115%，相對標準偏差（RSD）為0.55%～12.82%。

2.2.2 基質效應

基于2.2.1中3種提取劑和4種凈化劑的自由組合下，異丙隆和脫甲基異丙隆均具有較好的回收率，因此，本試驗為了減少雜質對儀器的損害，進行了基質效應的測定和計算。異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆在不同基質、提取溶劑和凈化劑中的基質效應的結果如圖3所示，在6種基質中異丙隆的基質效應范圍在-7.9%～203.3%之間，其中雞肉、牛肉、牛奶和小麥4種基質中提取溶劑和凈化劑為2%甲酸乙腈和PSA時基質效應最小，提取溶劑和凈化劑分別為乙腈和MWCTNs時大米的基質效應最小，提取溶劑和凈化劑分別為2%甲酸乙腈和florisil時雞蛋的基質效應最小;脫甲基異丙隆的基質效應范圍在-1.9%～162.8%之間，其中雞肉、牛肉、牛奶和小麥4種基質中提取溶劑和凈化劑為2%甲酸乙腈和PSA時基質效應最小，提取溶劑和凈化劑分別為2%甲酸乙腈和C18時大米的基質效應最小，提取溶劑和凈化劑分別為1%甲酸乙腈和florisil時雞蛋的基質效應最小。為了在檢測過程中降低基質效應對儀器的影響，在保證回收率的情況下，選擇基質效應影響小的提取溶劑和凈化劑作為提取方法。因此，經過對回收率和基質效應的綜合對比，選擇了2%甲酸乙腈作為提取劑和PSA作為凈化劑。

2.3 線性關系和定量限

分別用小麥、大米、牛肉、牛奶、雞肉、雞蛋基質空白溶液配制1、5、10、50、100、500 μg/L和1 000 μg/L的異丙隆和脫甲基異丙隆標準溶液，按2.2前處理方法中所確定的色譜質譜條件進行測定。在1～1 000 μg/L范圍內，異丙隆和脫甲基異丙隆的峰面積與質量濃度具有良好的線性關系（R2≥0.991 7），滿足外標法定量檢測的要求，其中線性回歸方程及相關系數等參數見表3。以最小添加回收濃度確定兩種目標化合物的定量限，定量限均為1 μg/kg。

2.4 方法的準確度和精密度

本方法的準確度及精密度用添加回收率和相對標準偏差來衡量。如表4所示，對異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆在6種空白基質進行4個水平添加回收試驗（1、10、50 μg/kg和500 μg/kg），在3個不同的時間制備樣品，每個水平重復5次。根據所述方法提取和凈化異丙隆及脫甲基異丙隆，異丙隆日內平均回收率在74.0%～107.0%之間，相對標準偏差0.7%～12.9%;日間平均回收率在76.2%～108.7%，相對標準偏差在1.1%～19.8%之間。異丙隆代謝物脫甲基異丙隆日內平均回收率在76.9%～113.5%之間，相對標準偏差0.6%～13.9%;日間平均回收率在77.7%～107.4%之間，相對標準偏差在2.2%～17.4%之間。結果表明，本方法的準確性、再現性均符合我國農藥殘留分析的要求[25]。

2.5 實際樣品測定

采用本研究建立的異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆殘留分析方法，對從農產品市場上購買的大米、小麥、牛肉、牛奶、雞肉和雞蛋6種基質各10份，共60份樣品進行檢測。結果如表5所示，實際樣品異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆殘留量在牛肉、牛奶、雞肉和雞蛋4種基質未檢出。異丙隆在大米中檢出2次，檢出含量1.6～7.5 μg/kg。脫甲基異丙隆在大米中檢出2次，檢出含量3.6～5.8 μg/kg;在小麥種檢出2次，檢出含量1.4～3.9 μg/kg。

3 結論

本研究建立了同時測定大米、小麥、牛肉、牛奶、雞肉、雞蛋6種基質中異丙隆及其代謝物脫甲基異丙隆的一種簡便可靠的殘留分析方法。該方法能夠同時制備6種不同的基質樣品，并通過超高效液相色譜串聯質譜（UHPLC-MS/MS）方法進行分析。樣品前處理操作簡單，方法的線性范圍、檢測限、定量限、平均添加回收率及其相對標準偏差等性能指標均滿足農藥殘留分析要求，適用于常用除草劑中異丙隆及脫甲基異丙隆多殘留的快速、準確定性和定量分析。

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（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190910?? 修訂日期： 20191117

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（201503017）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者E-mail：吳小虎xhwu@ippcaas.cn;秦樊鑫qinfanxin@gznu.edu.cn

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