兩種水稻蛀莖害蟲精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

魯艷輝 鄭許松 田俊策 白琪 呂仲賢

摘要 精氨酸激酶（AK， EC 2.7.3.3）是昆蟲體內唯一的磷酸原激酶，參與能量代謝。為探究AK基因的作用，本文利用本實驗室建立的cDNA文庫及RACE技術，分別從兩種重要的水稻蛀莖害蟲稻蛀莖夜蛾Sesamia inferens和二化螟Chilo suppressalis中克隆獲得了AK基因的cDNA全長序列，并對其序列特征進行分析。AK基因分別命名為SinAK（稻蛀莖夜蛾，GenBank登錄號：MK559476）和CsuAK（二化螟，MK559475），開放閱讀框（ORF）長為1 065 bp，編碼355個氨基酸，預測蛋白質分子量為40.0 kDa，等電點為5.88。氨基酸序列分析結果顯示SinAK、CsuAK基因編碼的氨基酸序列具有AK典型的功能位點保守序列：底物識別域S62G63V64-Y67和酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT。氨基酸序列比對及系統進化關系分析表明，SinAK與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的同源性最高，達95%以上，而CsuAK與印度谷螟、亞洲玉米螟的進化關系較近，同源性在95%左右。SinAK、CsuAK與其他昆蟲AK的氨基酸序列同源性也高于80%，而與部分脊椎動物起同樣作用的肌酸激酶（CK）的同源性低于40%，說明AK基因的功能是高度保守的，且與脊椎動物CK同源性很低。本研究結果為進一步研究SinAK和CsuAK的功能以及開發以AK基因為靶標的、對高等動物安全的害蟲防治新技術奠定基礎。

關鍵詞 水稻蛀莖害蟲; 稻蛀莖夜蛾; 二化螟; AK基因; 克隆; 序列

中圖分類號： S 435.112.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019083

Cloning and sequence analysis of arginine kinase genes from two rice stem borer species

LU Yanhui， ZHENG Xusong， TIAN Junce， BAI Qi， L Zhongxian

（State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control， Institute of Plant Protection

and Microbiology of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310021， China）

Abstract

Arginine kinase （AK， EC 2.7.3.3） is an important regulation factor of energy metabolism in insect species. Aimed to explore the role of AK genes， in this study， two AK genes， named SinAK （GenBank accession number： MK559476）， CsuAK （MK559475） were isolated from Sesamia inferens and Chilo suppressalis larvae， respectively， using cDNA library and RACE methods. Either cDNA sequence contained a 1 065 bp open reading frame （ORF） encoding a polypeptide of 355 amino acids with the predicted molecular weight and isoelectric point of 40.0 kD and 5.88， respectively. Amino acid sequence analysis showed that the SinAK and CsuAK sequences had the typical characteristics of arginine kinase， which contained the substrate recognition region S62G63V64-Y67 and the active site CP（S/T）N（I/L）GT. The results of sequence comparison and phylogenetic analysis showed that SinAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Spodoptera exigua， Spodoptera frugiperda and Spodoptera litura， while CsuAK shared more than 95% amino acid sequence identity with AKs from Plodia interpunctella and Ostrinia furnacalis. The amino acid sequence identities of SinAK and CsuAK with other insect AKs were also higher than 80%， while those with creatine kinases （CK） which play the same role in some vertebrates were lower than 40%. These results indicated that the function of AKs gene is highly conserved but they shared very low homology with vertebrate CK. Our results lay a foundation for further study of the functions of SinAK and CsuAK， and for the development of new pest control technologies targeting AK genes， which is safe for higher animal.

Key words

rice stem borer; Sesamia inferens; Chilo suppressalis; AK gene; clone; sequence

磷酸原激酶是一大類酶的總稱，多位于動物體內能量消耗較大的組織，對動物體內能量的儲存、代謝和利用具有至關重要的作用[12]。精氨酸激酶（arginine kinase， AK， EC 2.7.3.3）是無脊椎動物體內主要的磷酸原激酶[3]，起著類似于脊椎動物肌酸激酶（creatine kinase， CK）的作用，它通過催化精氨酸和ATP之間的可逆性反應，將能量存儲于磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中，或將磷酸精氨酸分解產生ATP[4]。近年來，關于AK的研究主要集中在基因序列。基因編碼氨基酸，氨基酸序列決定著蛋白的空間構型，因此，分析AK基因編碼的氨基酸序列及其特征，能夠明確酶的活性中心，為后續的AK功能研究奠定基礎[5]。迄今為止，人們已在鞘翅目、鱗翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目和蜚蠊目等昆蟲中發現AK[59]，并克隆分析了AK基因及其序列特征。主要包括南美沙漠蝗Schistocerca americana[10]、西方蜜蜂Apis mellifera[11]、印度谷螟Plodia interpunctella[12]、家蠶Bombyx mori[4， 13]、東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis[1415]、大紅芫菁Cissites cephalotes[16]、美洲大蠊Periplaneta americana[1718]、棉鈴蟲Helicoverpa armigera[19]、紅火蟻Solenopsis invicta[20]、意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica[21]、煙青蟲Helicoverpa assulta[22]、家蠅Musca domestica[23]等多種昆蟲，推動了昆蟲AK相關研究工作的開展。

稻蛀莖夜蛾（原稱大螟）Sesamia inferens（Walker）和二化螟Chilo suppressalis（Walker）是水稻的主要鉆蛀性害蟲，是大部分水稻產區的蛀莖害蟲優勢種，分別屬于鱗翅目夜蛾科Noctuidae和螟蛾科Pyralidae，東亞地區主要發生分布在中國、韓國、日本水稻產區，直接威脅農業生產[24]。目前，對于水稻蛀莖害蟲的防治，我國多施用化學藥劑。但由于化學藥劑的長期、大量、不合理使用等原因，導致害蟲抗藥性水平不斷提高，田間防效下降，從而加劇了蛀莖害蟲危害，而且對環境生態安全和食品安全造成嚴重的影響。因此，在控制害蟲抗藥性的策略上，篩選新的殺蟲劑作用靶標已成為農藥創新領域的重要方向。

已有研究表明，AK是昆蟲肌肉中唯一有效形成ATP 的磷酰基供體，這就意味著昆蟲具有與脊椎動物完全不同的能量代謝途徑[5， 1617， 22， 2526]，若將AK作為靶標，開發害蟲防治新技術，不僅可以開辟害蟲分子調控的新領域，而且對高等動物也比較安全[22， 27]。本文以兩種重要的水稻害蟲為研究對象，利用本實驗室建立的cDNA文庫和RACE技術，克隆其AK基因并分析該基因的序列特征，旨在為深入研究AK的表達、調控、功能以及探求水稻蛀莖害蟲綠色防控的分子靶標提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

稻蛀莖夜蛾和二化螟室內種群采自浙江省杭州市蕭山區義橋鎮（30°07′ N， 120°21′ E）水稻田，采用人工飼料在人工氣候室飼養，飼料配方及飼養方法參考中國水稻研究所的方法（稻蛀莖夜蛾[28]，二化螟[29]）。飼養條件：溫度 27℃±1℃，相對濕度（70±5）%，光周期L∥D=16 h∥8 h。成蟲利用10%的蜂蜜水飼養。

1.2 總RNA提取

兩種蛀莖害蟲總RNA的提取采用TRIzol試劑，具體步驟參照TRIzol試劑說明書（Invitrogen）。取1 μL RNA樣品測定OD260/280（Nanodrop 2000），比值在1.8～2.2之間的樣品用于cDNA合成。

1.3 AK基因全長序列的獲得

通過對本實驗室建立的稻蛀莖夜蛾和二化螟cDNA文庫測序，分別獲得了這兩種水稻害蟲AK基因的cDNA序列，利用Primer 3.0軟件設計RACE引物（表1）。取這兩種害蟲的3齡幼蟲，按照上述操作步驟提取總RNA，取1.0 μg RNA，按照RACE試劑盒（TaKaRa-Clontech）的操作說明合成5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA。用RACE引物F1和R1分別與試劑盒提供的UPM引物進行第一輪PCR擴增，以RACE引物F2和R2分別與試劑盒提供的NUP引物進行第二輪擴增。兩輪PCR擴增程序同為：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環;72℃延伸5 min。擴增片段與pMD-18T載體（TaKaRa）連接，轉化，菌落PCR鑒定正確后進行測序（南京擎科生物科技有限公司）。

1.4 序列分析

測序結果采用DNAMAN軟件進行拼接，獲得兩種水稻害蟲AK基因的全長cDNA序列。序列同源性比對采用ClustalW軟件（http：∥www.genome.jp/tools/clustalw/）。利用MEGA 5.1軟件建立系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 兩種水稻害蟲AK基因全長cDNA序列的克隆與特征分析

克隆獲得兩種水稻害蟲AK基因的全長cDNA序列，分別命名為SinAK（稻蛀莖夜蛾）和CsuAK（二化螟）。SinAK基因cDNA全長為1 422 bp，CsuAK基因cDNA全長為1 597 bp。開放閱讀框（ORF）均為1 065 bp，編碼355個氨基酸，預測蛋白的分子量為40 kDa，等電點為5.88。GenBank登錄號分別為，稻蛀莖夜蛾MK559476、二化螟MK559475（圖1～2）。預測到一個底物識別域S62G63V64-Y67;酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，位于氨基酸270-276;一個肌動蛋白結合域ENKTFLVWCNE，位于氨基酸213-223（圖1～2）。

2.2 兩種水稻害蟲與其他動物AK或CK序列的比對

將克隆獲得的稻蛀莖夜蛾和二化螟AK基因與NCBI數據庫（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中注冊的部分昆蟲AK和其他物種的CK編碼氨基酸序列進行比對，發現其與鱗翅目昆蟲的AK基因編碼的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;與其他昆蟲，例如褐飛虱Nilaparvata lugens（Stl）（半翅目）和黑腹果蠅Drosophila melanogaster（雙翅目）的同源性較高，在80%左右;與幾種害蟲的天敵昆蟲如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita、二化螟盤絨繭蜂Cotesia chilonis的同源性也較高，在80%左右;而與人Homo sapiens、電鰩Tetronarce californica、褐家鼠Rattus norvegicus的CK的同源性較低，低于40%（圖3，表2）。

2.3 兩種水稻害蟲與其他動物AK或CK序列的系統進化樹分析

采用MEGA 5.1軟件對NCBI數據庫中注冊的部分昆蟲的AK和部分脊椎動物的肌酸激酶的氨基酸序列構建了系統進化樹，進化樹顯示兩個大的分支，一支為精氨酸激酶類，另一支為肌酸激酶類（圖4）。進化樹的結果顯示：SinAK和CsuAK氨基酸序列歸屬于AK分支。SinAK與甜菜夜蛾Spodoptera exigua、草地貪夜蛾S.frugiperda和斜紋夜蛾S.litura的同源性最高，達95%左右;CsuAK與印度谷螟Plodia interpunctella、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis的進化關系較近，同源性在95%左右;雖然與幾種害蟲的天敵昆蟲如蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum、茶足柄瘤蚜繭蜂Lysiphlebus testaceipes、小峰熊蜂Bombus hypocrita也屬于同一AK分支，但同源性相對低一些，在80%左右（圖4）。

3 討論

目前，人們在多種昆蟲中發現AK，主要集中在鱗翅目、鞘翅目、膜翅目、直翅目、雙翅目和蜚蠊目中。許多研究表明，AK是昆蟲體內唯一能夠形成有效ATP 的磷酰基供體[5]，但關于稻蛀莖夜蛾和二化螟這兩種重要水稻害蟲AK基因的研究相對較少。本研究利用已建立的cDNA文庫和RACE技術，獲得稻蛀莖夜蛾和二化螟AK基因cDNA全長序列，分別命名為SinAK（GenBank登錄號：MK559476）和CsuAK（GenBank登錄號：MK559475）。ORF均為1 065 bp，編碼355個氨基酸，預測蛋白的分子量為40 kDa，等電點為5.88。這與NCBI中注冊的大部分昆蟲AK相似。氨基酸序列中預測到一個底物識別域S62G63V64-Y67，酶活性中心序列CP（S/T）N（I/L）GT，一個肌動蛋白結合域ENKTFLVWCNE，其中酶活性中心序列中含有保守的半胱氨酸C270，這些都是AK基因的功能位點。Gattis等研究表明，酶活性中心序列中的半胱氨酸在精氨酸激酶的催化過程中起關鍵作用[31]。將克隆獲得的SinAK、CsuAK與NCBI數據庫中注冊的其他昆蟲AK基因進行比對分析，發現其與鱗翅目昆蟲的AK基因編碼的氨基酸序列同源性最高，在90%以上;與褐飛虱和黑腹果蠅的同源性較高，高于80%，且上述幾個功能位點都是高度保守的，說明AK基因的功能是高度保守的[32]。而SinAK、CsuAK與部分脊椎動物，比如人、電鰩、倉鼠的肌酸激酶的同源性低于40%。進化樹的結果顯示SinAK與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾和斜紋夜蛾的同源性最高，達95%左右;CsuAK與印度谷螟、亞洲玉米螟的進化關系較近，同源性在95%左右，這應該與昆蟲的分類地位相關，稻蛀莖夜蛾與甜菜夜蛾、草地貪夜蛾、斜紋夜蛾同屬于鱗翅目夜蛾科，而二化螟與印度谷螟和亞洲玉米螟同屬于鱗翅目螟蛾科。

精氨酸激酶是昆蟲能量代謝途徑中的關鍵酶，且僅存在于無脊椎動物體內，與脊椎動物中起同樣作用的肌酸激酶序列同源性較低，可作為害蟲防治的一個分子靶標。本文結果為揭示稻蛀莖夜蛾、二化螟AK的基因功能奠定基礎，為利用以SinAK、CsuAK基因為靶標的水稻綠色防控技術的研發提供了基礎依據。雖然以AK基因為靶標的防控策略可以保證脊椎動物的安全，但天敵昆蟲的AK基因序列與害蟲較為相似，以AK基因為靶標可能會作用于天敵。幸運的是天敵與害蟲的AK基因同源性為80%左右，因此仍有空間尋找對害蟲特異性的靶標，導入雙鏈RNA（dsRNA）干擾AK基因的功能，從而導致害蟲生長發育受阻，甚至死亡。在后續的工作中我們將側重于在害蟲與天敵AK基因差異較大的序列區域開展潛在的特異性靶標研究。

參考文獻

[1] NEWSHOLME E A， BEIS I， LEECH A R， et al. Role of creatine kinase and arginine kinase in muscle [J]. Biochemical Journal， 1978， 172（3）： 533537.

[2] ELLINGTON W R. Phosphocreatine represents a thermodynamic and functional improvement over other muscle phosphagens [J]. Journal of Experimental Biology， 1989， 143： 177194.

[3] AWAMA A M， MAZON H， VIAL C， et al. Despite its high similarity with monomeric arginine kinase， muscle creatine kinase is only enzymatically active as a dimer [J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2007， 458（2）： 158166.

[4] 王華兵， 徐豫松. 家蠶精氨酸激酶基因的克隆、基因結構與表達分析[J]. 中國農業科學， 2006， 39（11）： 23542361.

[5] 鄭雅楠， 劉佩旋， 時勇， 等. 昆蟲精氨酸激酶研究進展[J].昆蟲學報， 2018， 61（3）： 385390.

[6] 朱家穎. 蝶蛹金小蜂毒液分子特性及其調控寄主分子機理的研究[D]. 杭州：浙江大學，2009.

[7] WERR M， CRAMER J T. Identification and characterization of two arginine kinases from the parasitic insect Ctenocephalides felis [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2009， 39（9）： 634645.

[8] 閆浩， 夏立新， 陳家杰， 等. 德國小蠊精氨酸激酶基因的克隆、表達及免疫活性測定[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志， 2011， 29（3）： 191194.

[9] 王磊. 蝶蛹金小蜂毒液蛋白質組與四個毒液蛋白生理功能的分析[D]. 杭州： 浙江大學， 2012.

[10]WANG Yumei， ESBENSEN P， BENTLEY D. Arginine kinase expression and localization in growth cone migration [J]. Journal of Neuroscience， 1998， 18： 987998.

[11]KUCHARSKI R， MALESZKA R. Arginine kinase is highly expressed in the compound eye of the honey bee， Apis mellifera [J]. Gene， 1998， 211（2）： 343349.

[12]BINDER M， MAHLER V， HAYEK B， et al. Molecular and immunological characterization of arginine kinase from the Indian meal moth， Plodia interpunctella， a novel cross-reactive invertebrate panallergen [J]. Journal of Immunology， 2001， 167（9）： 54705477.

[13]LIU Zhigang， XIA Lixin， WU Yulan， et al. Identification and characterization of an arginine kinase as a major allergen from silkworm （Bombyx mori） larvae [J]. International Archives of Allergy and Immunology， 2009， 150（1）： 814.

[14]LI Miao， WANG Xiaoyun， BAI Jigang. Purification and characterization of arginine kinase from locust [J]. Protein and Peptide Letter， 2006， 13（4）： 405410.

[15]WU Qingyun， LI Feng， ZHU Wenjing， et al. Cloning， expression， purification， and characterization of arginine kinase from Locusta migratoria manilensis [J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part B， 2007， 148（4）： 355362.

[16]TANAKA K， ICHINARI S， IWANAMI K， et al. Arginine kinase from the beetle Cissites cephalotes （Olivier）. Molecular cloning， phylogenetic analysis and enzymatic properties [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology， 2007， 37（4）： 338345.

[17]BROWN A E， FRANCE R M， GROSSMAN S H. Purification and characterization of arginine kinase from the American cockroach （Periplaneta americana） [J]. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 2004， 56（2）： 5160.

[18]陳家杰， 夏立新， 劉志剛， 等. 美洲大蠊精氨酸激酶基因的克隆、表達及變應原活性測定[J]. 中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志， 2008， 26（5）： 356360.

[19]LIU Feng， WANG Xiaodong， ZHAO Yiying， et al. Silencing the HaAK gene by transgenic plant-mediated RNAi impairs larval growth of Helicoverpa armigera [J]. International Journal of Biological Sciences， 2015， 11（1）： 6774.

[20]WANG Haichuan， ZHANG Lan， ZHANG Lee， et al. Arginine kinase： differentiation of gene expression and protein activity in the red imported fire ant， Solenopsis invicta [J]. Gene， 2009， 430（1/2）： 3843.

[21]AL-LAWATI H， KAMP G， BIENEFELD K. Characteristics of the spermathecal contents of old and young honeybee queens [J]. Journal of Insect Physiology， 2009， 55（2）： 117122.

[22]張元臣， 安世恒， 李為爭， 等. 煙夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表達分析[J]. 昆蟲學報， 2011， 54（7）： 754761.

[23]于雪， 曹新茹， 高一夫， 等. 家蠅精氨酸激酶基因克隆及其在害蟲防治上的應用[J]. 河北大學學報（自然科學版）， 2015， 35（1）： 7075.

[24]魯艷輝， 高廣春， 鄭許松， 等.不同生育期和氮肥水平對水稻害蟲誘集植物香根草揮發物的影響[J]. 中國生物防治學報， 2016， 32（5）： 604609.

[25]NITAT， WANPEN C， ANCHALEE T， et al. Periplaneta americana arginine kinase as a major cockroach allergen among Thai patients with major cockroach allergies [J]. Environmental Health Perspectives， 2006， 114（6）： 875880.

[26]張元臣， 安世恒， 原國輝. 昆蟲精氨酸激酶的研究進展[J]. 應用昆蟲學報， 2013， 50（2）： 533538.

[27]ZHAO Yiying， YANG Guang， WANG G， et al. Phyllotreta striolata （Coleoptera： Chrysomelidae）： arginine kinase cloning and RNAi based pest control [J]. European Journal of Entomology， 2008， 105（5）： 815822.

[28]戴長庚， 李凱龍， 王立峰， 等.基于均勻設計優化的大螟實用飼料配方及繼代飼養[J].中國水稻科學， 2013， 27（4）： 434439.

[29]胡陽， 鄭永利， 曹國連， 等. 利用半人工飼料大規模簡便化飼養二化螟[J].中國水稻科學， 2013， 27（5）： 535538.

[30]袁淼. 褐飛虱內參基因的篩選及精氨酸激酶基因的分子特性研究[D]. 武漢： 華中農業大學， 2014.

[31]GATTIS J L， RUBEN E， FENLEY M O， et al. The active site cysteine of arginine kinase： structural and functional analysis of partially active mutants [J]. Biochemistry， 2004， 43（27）： 86808689.

[32]王磊， 黃體冉， 李光棟， 等. 朱砂葉螨精氨酸激酶基因的克隆與表達特征[J]. 北京農學院學報， 2018， 33（3）： 1623.

（責任編輯：楊明麗）

收稿日期： 20190226?? 修訂日期： 20190627

基金項目：國家自然科學基金（31672050）;浙江省重點研發計劃（2018C02032）;浙江省“三農六方”科技協作項目（CTZB-F170623LWZ-SNY1）

致? 謝： 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀燁斌等同學，特此一并致謝。

通信作者?E-mail：luzxmh@163.com

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