伯氏疏螺旋體套式PCR檢測方法建立及應用

王婭，劉麗婭，謝彩云，馬曉菁，葉鋒，谷文喜，馬俊杰，鐘旗，易新萍*

(1. 新疆畜牧科學院獸醫研究所/新疆畜牧科學院動物臨床醫學研究中心，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830000)

萊姆病是一種由伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)感染引起，經硬蜱叮咬吸血時進行傳播的自然疫源性人畜共患病[1]。可侵害人體多系統及臟器，臨床表現多樣化。該病分布廣、傳播快、致殘率高，近年來疫源地及發病率均呈現出擴大和上升趨勢，已成為嚴重的世界性公共衛生問題[2-3]。

收稿日期：2019-08-29；修回日期：2020-04-07

基金項目：國家重點研發計劃項目(2017YFC1200500)

第一作者：王婭(1997-)，女，碩士研究生；劉麗婭(1984-)，女，碩士，副研究員。#共同第一作者

*通信作者：易新萍，研究員，研究方向為動物傳染病，E-mail：821489803@qq.com。

新疆的氣候條件、植被資源為蜱蟲的孕育及蜱傳疫病的傳播提供了良好的生態條件，是我國萊姆病的重要疫區[4]。據報道至少能在 35 種蜱和少數吸血蚊、蠅、虻、螨、蚤類體內分離到萊姆病螺旋體，但具有保持和傳播萊姆病螺旋體能力的只有硬蜱類[5]。本研究選擇伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區設計特異性引物，建立萊姆病套式PCR檢測方法，對2018—2019年采集的硬蜱樣本進行檢測，以此來了解新疆北疆地區硬蜱攜帶伯氏疏螺旋體的流行現狀，以期為疫病的防控提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

伯氏疏螺旋體B31標準株(ATCC35210)、大腸桿菌標準株(CVCC1531)、沙門菌標準株(CVCC3762)、鉤端螺線體基因組DNA(DSM21537)均由新疆畜牧科學院獸醫研究所保存。

1.1.2 試劑

PCR Mix，北京莊盟生物技術有限公司；1×PBS稀釋液、TE稀釋液、DNA Marker，上海生工生物工程技術服務有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；BSK培養基，美國Sigma公司；LB培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 對照樣品DNA的提取

將伯氏疏螺旋體B31標準株、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌進行培養后，按細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明分別提取DNA。

1.2.2 套氏PCR檢測方法

1.2.2.1 引物設計與合成

在伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因(GenBank登錄號JX564636.1)間隔區設計套式PCR引物，并委托昆泰銳生物技術有限責任公司合成，引物序列見表1。

表1 5S-23S rRNA間隔區套式PCR引物序列

名稱引物序列(5'→3')退火溫度/℃片段大小/bp23SN1ACCATAGACTCTTACTTTGAC23SC1TAAGCTGACTAATACTAATTACCC5538023SN2ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA5SCBGAGAGTAGGTTATTGCCAGGG62225

1.2.2.2 反應體系

進行2輪PCR反應，每輪體系均為25 μL：包括2×TaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，雙蒸水8.5 μL，第1輪模板為2 μL，第2輪模板為第1輪PCR產物2 μL。

1.2.2.3 反應條件

第1輪PCR使用引物為23SN1和23SC1，擴增程序如下：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環；再72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應。第2輪PCR使用引物為23SN2和5SCB，擴增程序如下：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環；再72 ℃延伸10 min，16 ℃終止反應。

1.2.2.4 產物檢測

用TAE電泳稀釋液配置1%瓊脂凝膠，取5 μL套式PCR擴增產物分別加入樣品孔，以100 V恒壓電泳，采用凝膠成像系統拍照，陽性可見約為225 bp左右的條帶。

1.2.2.5 敏感性試驗

將提取的伯氏疏螺旋體B31標準株DNA應用分光光度計進行含量測定，稀釋至1 ng/μL后進行10倍系列稀釋，濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL，取2 μL為模板進行套式PCR 擴增，以檢測其敏感性。

1.2.2.6 特異性試驗

以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鉤端螺旋體、伯氏疏螺旋體B31標準株DNA為模板，進行套式 PCR 擴增以檢測其特異性。

1.2.3 檢測蜱蟲樣本DNA提取

在新疆伊犁地區、阿拉山口、呼圖壁縣、青河縣、福海縣和五家渠縣采集游離蜱和吸血蜱共534只。將蜱浸泡于75%酒精中15 min，再用1×PBS稀釋液或生理鹽水清洗3次，放置于干凈的濾紙上吸水干燥。干燥后用鑷子將蜱夾放在無菌載玻片上縱切，加適量TE進行研磨，煮沸10 min，8 000 r/min離心5 min后取上清，保存于-20 ℃用于檢測。

2 結果

2.1 套氏PCR敏感性及特異性

2.1.1 敏感性

應用建立的套式PCR檢測方法，對稀釋后的伯氏疏螺旋體B31標準株DNA進行擴增，電泳后檢測，其檢測限約為1.0×10-3ng/μL，結果如圖1所示。

2.1.2 特異性

應用建立的套式PCR檢測方法，以伯氏疏螺旋體標準菌株B31和金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鉤端螺旋體的DNA為模板進行擴增，電泳后顯示，除伯氏疏螺旋體標準菌株B31擴增出225 bp大小的目的條帶，其他未見條帶，結果如圖2所示。

2.2 螺旋體的檢測

應用建立的套式PCR檢測方法，對在新疆北疆6個地區采集的534只硬蜱進行檢測，共檢出81份陽性，總陽性率為15.17%。其中青河縣檢測蜱110只，陽性26只，陽性率最高為23.64%；福海縣檢測蜱18只，全為陰性；其余地區陽性率由高到低依次為呼圖壁縣22.73%、阿拉山口市18.06%、伊犁地區17.75%、五家渠縣2.5%，具體結果見表2、圖3。

M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2～7.伯氏疏螺旋體標準菌株B31陽性質粒陽性對照(1 ng/μL)、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/μL

圖1 套式PCR敏感性檢測

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋體標準菌株B31；2.金黃色葡萄球菌；3.大腸桿菌；4.沙門菌；5.鉤端螺旋體

圖2 套式PCR特異性檢測

表2 蜱樣本巢氏PCR 檢測結果

采樣地檢測數陽性數陽性率/%伊犁地區4縣市1602213.75阿拉山口市1442618.06呼圖壁縣22522.73青河縣1102623.64福海縣1800.00五家渠縣8022.50總 計5348115.17

M. DL2000 DNA Marker；1.伯氏疏螺旋體標準菌株B31；2.陰性對照；3～17.檢測蜱樣本

圖3 部分蜱樣本套式PCR檢測結果

3 討論

萊姆病診斷的“金標準”是從樣本中分離出伯氏疏螺旋體，但其體外分離培養難度大，耗時長、成本高、易污染，且分離率較低。血清學檢測方法敏感性和靈敏性又不高，因而分子生物學檢測方法越來越多的被應用于萊姆病的檢測。套式PCR(Nested-PCR)是一種普通PCR的優化模式，原理是設計2對引物，第2對引物在第1對引物的內部，將第1輪PCR的產物作為第2輪PCR的模板進行擴增[6]。其敏感度和特異性均高于普通PCR，被認為是臨床檢測螺旋體菌屬最敏感的方法之一[7]。本研究選擇伯氏疏螺旋體5S-23S rRNA基因間隔區成功設計嵌套式引物，以此為基礎建立了套式PCR檢測體系，評估了該方法的敏感性和特異性，并成功應用于檢測臨床樣本。

自1987年以來，新疆已先后被證實存在多個萊姆病自然疫源地[8-10]。萊姆病通過蜱作為媒介進行傳播，要深入地探討萊姆病的發生與傳播的機制，首先需要了解各地蜱伯氏疏螺旋體的帶菌情況。本研究對新疆北疆6個地區采集的硬蜱攜帶伯氏疏螺旋體流行現狀進行調查，結果顯示6個地區硬蜱伯氏疏螺旋體平均攜帶率為15.17%。其中青河縣最高，達23.64%，福海縣未檢測到。不同地區間存在差別，與采集的樣本數量有關，也可能與采集區域是否是疫源地或萊姆病高發區有關[11]。

牛、羊、犬、兔、鹿和鼠等動物均可感染萊姆病，又通過蜱叮咬后傳播給人，該病對人類健康和畜牧業發展已構成極大危害。鑒于此次調查得知新疆北疆地區蜱萊姆病伯氏疏螺旋體攜帶率較高，應加強萊姆病的防控工作，長期開展蜱蟲分布及蜱傳疫病檢測監測，了解其傳播和流行風險，及時預警預報。同時，應做好滅蜱工作，對長期在野外、戶外及蜱棲息地、萊姆病疫源地停留的人員，要加強萊姆病防控知識的科普宣傳，提高自我防護意識。