基于新城疫活疫苗LaSota研究血凝試驗影響因素

吳雙，柯裕豐，朱善元，吳植，姜勇,2，謝軍

(1. 江蘇農牧科技職業學院，江蘇 泰州 225300；2. 揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是養雞行業的“頭號殺手”之一，也是危害最大的傳染病病原之一[1]。NDV具有囊膜，其囊膜表面含有一定數量的血凝素，能夠凝集雞、鴨、鵝、豚鼠和人的“O型血”的紅細胞[2]，以及非洲綠猴腎細胞[3]。故可用HA試驗檢測尿囊液中病毒是否具有血凝性，在HA試驗結果基礎上可以進行血凝抑制試驗，進而明確該養禽場的新城疫抗體水平。HA試驗具有操作簡便、快速和實用性強等特點，但影響因素較多[4]。涉及1%紅細胞懸液的保存時間、抗凝血在4 ℃保存時間、抗原凍融次數、凍融的抗原在4 ℃保存時間、不同稀釋液對HA結果的影響，延長1%紅細胞懸液的保存時間等問題。為了減少影響因素的干擾，同時也為實際操作提供參考建議，本文對HA試驗上述諸多影響因素進行了研究。

1 材料與方法

1.1 生物材料

SPF雛雞和SPF種蛋均購自浙江立華農業科技有限公司。SPF雛雞由江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室在禽隔離器飼養至成年；SPF種蛋自行孵化至10日齡。新城疫活疫苗(LaSota)購自青島易邦生物工程有限公司。

1.2 HA試驗操作

參考GB/T 16550-2008 新城疫診斷技術文件，進行HA試驗規范操作，在正確使用移液器的前提下，確保抗原倍比稀釋的準確性[5-6]，充分混勻后在室溫(20～25 ℃)下靜置反應，當不加LaSota尿囊液對照孔的紅細胞呈明顯鈕扣狀時判讀結果，以完全凝集的病毒最大稀釋度為該NDV的血凝效價[7-8]。

1.3 NDV LaSota尿囊液的擴繁

NDV疫苗株LaSota稀釋104倍接種5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.1 mL/枚，孵育96 h時收獲尿囊液，每枚雞胚的尿囊液單獨收獲且單獨測定其HA效價；選擇HA效價最高的尿囊液經稀釋106倍后接種5枚10日齡SPF雞胚尿囊腔，0.1 mL/枚；按照上述操作再雞胚傳代1次。本試驗中所用的尿囊液來自同一枚雞胚，共收獲6.0 mL尿囊液，每只指形管分裝0.1 mL，共分裝60支，保存于-80 ℃冰箱中，使用前室溫自然融解[9-10]。

1.4 1%紅細胞懸液的制備方法

采血器預先吸取適量的3.8%枸櫞酸鈉溶液并潤濕管壁，按照抗凝劑∶血液=1∶4的比例采集SPF抗凝血。通過翅靜脈或心臟途徑采集血液，將采集的3份抗凝血混勻后取適量抗凝血置入離心管中，加入3倍至4倍體積的稀釋液混勻，分別以2 000 r/min離心3次，第1次5 min，第2次5 min，第3次8 min，棄凈血漿和白細胞，最后吸取壓積紅細胞用稀釋液配成體積分數為1%的紅細胞懸液，于4 ℃保存備用[11]。

1.5 存放容器種類對抗凝血的影響

按照1.4的操作方法每只雞采集20 mL抗凝血，3只雞的抗凝血混勻后分裝為15 mL離心管組、100 mL燒杯組、100 mL燒杯+等體積PBS 3組，每組分裝4份5 mL抗凝血，分別存放于4 ℃冰箱的同一層中，保存時長為72 h，其中在0、24、48和72 h時每組各取1份抗凝血，按照1.4操作方法制備1%紅細胞懸液，同一時間點制備的1%紅細胞懸液在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，其中15 mL離心管組和100 mL燒杯組各進行3個重復操作，100 mL燒杯+等體積PBS組進行2個重復操作；上述每個時間點均從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原；本次試驗稀釋液選取PBS。

1.6 存放時長對1%紅細胞懸液的影響

根據抗凝血在不同容器內放置不同時間，選擇對HA效價結果影響最小的容器制備80 mL 1% 紅細胞懸液，將其分成4等份，并置于4 ℃冰箱的同一層隔板上，保存時長為72 h。分別于0、24、48、72 h時各取1份進行HA試驗，每個時間點進行3個重復操作；每個時間點操作前從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原，本次試驗稀釋液選取PBS。

1.7 保存溫度和凍融次數對抗原的影響

1.7.1 保存溫度對抗原的影響

同時從-80 ℃取出8支NDV LaSota尿囊液，分為室溫和4 ℃ 2 組，每組4支尿囊液；每組分別于0、24、48、72 h時各取1支尿囊液進行HA試驗。同一時間點尿囊液在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，并進行3個重復操作。本次試驗稀釋液選取PBS；1%紅細胞懸液按照1.4方法新鮮制備。

1.7.2 凍融次數對抗原的影響

從-80 ℃同時取出4支NDV LaSota尿囊液，分別于室溫和-80 ℃反復自然解融1、2、3和4次，HA試驗前從冰箱取出1支尿囊液和上述4支尿囊液同時進行HA試驗，相應的凍融次數依次為1、2、3、4、5次，每份尿囊液進行3個重復操作。本次試驗稀釋液選取PBS，本次試驗使用同一份新鮮制備的1%紅細胞懸液。

1.8 稀釋液的種類對HA效價的影響

將新鮮采集的60 mL混合抗凝血中，分裝于8個100 mL燒杯，5 mL/燒杯，將其分為0.9%氯化鈉和PBS 2 組，每組4個燒杯；分別置于冰箱4 ℃的同一層，保存時長為72 h，每組分別0、24、48和72 h各取1份抗凝血制備1%紅細胞懸液，1%紅細胞的制備以及相應的HA試驗均采用同組別的稀釋液。每個時間點均從-80 ℃取出1份凍存的尿囊液作為抗原，在同一塊血凝反應板中進行HA試驗，并進行3個重復。此外為了延長1%紅細胞懸液保存時間，采用0.75%氯化鈉加2%葡萄糖作為稀釋液，研究48 h內HA效價的變化。

2 結果與分析

2.1 存放容器種類對抗凝血的影響

抗凝血在15 mL離心管組中上清逐漸由蠟黃色向淡黃色變化，0 h后紅細胞逐漸沉降至離心管底部，白細胞于24 h懸浮于紅細胞表面并形成一層白細胞膜，72 h后仍懸浮于紅細胞表面。100 mL燒杯組中抗凝血上清清澈透明，0 h后紅細胞逐漸沉降至燒杯底部，24 h時白細胞大量懸浮于紅細胞表面，48 h后白細胞逐漸消失，72 h后白細胞肉眼不可見，出現少量血凝絲，血凝絲由存放時間的延長而增多。100 mL燒杯+等量PBS組抗凝血上清清澈透明，從0 h開始紅細胞逐漸沉降至燒杯底部，24 h白細胞呈點線狀少量懸浮于紅細胞表面。于每個時間點分別取5 mL抗凝血制備1%紅細胞懸液，進行HA試驗，結果見表1。

表1 5 mL抗凝血在不同容器內對HA效價的動態變化(log2)

組別0 h24 h48 h72 h96 h120 h15 mL離心管8875--100 mL燒杯888888100 mL燒杯+等體積PBS8876--

注：“-”表示因溶血嚴重未進行HA試驗。

由表1可知，在4 ℃存放條件下，抗凝血存放0和24 h時，3個試驗組的抗凝血制備的1%紅細胞懸液，測定的同一份抗原HA效價均為8log2；在24 h之后，15 mL離心管組和100 mL燒杯+等量PBS組內的抗凝血所檢測的HA效價開始不斷下降，72 h后差異顯著。3組中100 mL燒杯組的結果是最穩定的。

2.2 存放時長對1%紅細胞懸液的影響

1%紅細胞懸液在4 ℃保存條件下，于24 h時出現微溶血，48～72 h 1%紅細胞懸液溶血情況較24 h嚴重，相應地48～72 h的血凝反應板檢測孔內的紅細胞也是呈現出溶血現象，存放時長對1%紅細胞懸液的影響的具體結果如圖1所示。

圖1 1%雞紅細胞懸液于4 ℃存放時HA效價的動態變化

2.3 保存溫度對抗原的影響

NDV LaSota尿囊液對溫度非常敏感，在室溫20～25 ℃條件下，0～24 h、24～48 h間NDV LaSota尿囊液均下降1個滴度，48 h后趨于穩定；NDV LaSota尿囊液在4 ℃條件下，0～72 h均比較穩定(見圖2)。

圖2 不同保存溫度對LaSota尿囊液HA效價的動態影響

2.4 凍融次數對抗原的影響

NDV LaSota尿囊液在-80 ℃保存條件下，每凍融2次，下降1個血凝滴度，結果見圖3。

圖3 凍融次數對LaSota HA 效價的影響

2.5 稀釋液的種類對HA效價的影響

使用稀釋液0.9%氯化鈉和PBS制備的1%紅細胞懸液，在4 ℃存放72 h，其影響HA效價的動態變化如圖4所示。PBS 緩沖能力優于0.9% 氯化鈉，0.9% 氯化鈉組與PBS組相比普遍低1個滴度。HA 試驗中所用的稀釋液優先選擇 PBS。此外，0.75% 氯化鈉加2% 葡萄糖作為稀釋液，制備1%紅細胞懸液并進行 HA 試驗發現，此稀釋液能夠有效延長1% 紅細胞懸液的保存時間，在48 h內檢測到 LaSota 尿囊液 HA 效價均為9log2。

圖4 2種稀釋液對HA效價的動態影響

3 討論

當紅細胞處于一種非生理性模式時，在該模式的機械壓力或者高溫、低溫等情況下，紅細胞會發生細胞損失，常見的損傷表現為立即或者延遲性“溶血”，也有可能會發生“亞致死性損傷”[12]。溶血會導致紅細胞破碎、有效紅細胞數量減少、紅細胞比容降低，直接影響 NDV 的血凝素與紅細胞的有效凝集；同時紅細胞滲透脆性值不斷增大，隨著保存時間的不斷延長，紅細胞破壞加劇，溶血率顯著增加[13]。試驗結果表明未稀釋的抗凝血存放于較大容器內于4 ℃ 保存的時間更長，液體高度低會減少機械壓力，同時促使溶液中含氧量增多，亦有助于維持全血中的血小板數量、充分發揮白細胞吞噬細菌的功能及優化制備細胞懸液等優點[14-15]。因此在不影響試驗的情況下1% 紅細胞懸液應現配現用。凍融次數是影響 NDV LaSota 尿囊液的關鍵因素，其凍融次數會嚴重影響 HA 效價， 建議NDV LaSota尿囊液凍融次數不超過2 次。稀釋液對于 HA 效價影響較大，試驗結果表明 PBS 的緩沖效果略優于0.9% 的氯化鈉溶液。由于哺乳類動物需用生理鹽水濃度是0.9%，而禽類需用的生理鹽水濃度是0.75%，在后續試驗中亦比較了兩者的優劣，結果發現0.75% 氯化鈉濃度的緩沖效果更佳，與 PBS 效果相當。研究表明適當濃度的氯化鈉和葡萄糖不會引起紅細胞的溶血[16]。本試驗研究亦發現含2% 葡萄糖的0.75% 氯化鈉溶液可以維持 HA 效價為9log2 時長達48 h。通過研究發現影響HA試驗的因素比較多，除了操作技巧要熟練外，還需選擇最優條件進行，這樣才能獲得更準確可靠的結果。