局部進(jìn)展期直腸癌圍放療期外周血免疫功能指標(biāo)的變化

陳若，沈琦，羅文廣，雕麗瓊，張紅雁

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院腫瘤放療科，合肥 230001)

直腸癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，在全球惡性腫瘤發(fā)病率中居第3 位，死亡率居第4 位[1-2]。由于直腸癌解剖位置局限在狹窄的骨盆內(nèi)，增加了手術(shù)時(shí)保證完整切緣陰性的難度，也在一定程度上導(dǎo)致治療后出現(xiàn)并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)增大、局部復(fù)發(fā)率增高，特別是對(duì)于局部進(jìn)展期直腸癌，預(yù)后不良的比率更高[3]。現(xiàn)直腸癌的治療方式有手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療等，且直腸癌治療全程化的管理越來(lái)越趨向精細(xì)化、個(gè)性化。因此，如何利用多學(xué)科綜合治療的模式來(lái)提高直腸癌精準(zhǔn)治療程度以及降低直腸癌的死亡率，成為目前直腸癌臨床研究中亟待解決的問(wèn)題之一。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)直腸癌患者圍放療期外周血T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞(Treg 細(xì)胞)、自然殺傷細(xì)胞(NK 細(xì)胞)、血小板與淋巴細(xì)胞比值(PLR)的變化情況。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇安徽省立醫(yī)院腫瘤放療科2018 年1 月到2019 年10 月共54 例接受放射治療的直腸癌患者，其中男性35 例，女性19 例；年齡范圍27～87 歲，平均年齡為55.96 歲；病理為高分化腺癌8 例，中分化腺癌33 例，低分化腺癌13 例；根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)制訂的第8 版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ期14 例，Ⅲ期40 例。術(shù)前短程快速大分割放療9 例，術(shù)前常規(guī)分割放療17 例，術(shù)后常規(guī)分割放療28 例。本研究經(jīng)安徽省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批件號(hào)：2019KY 倫審第101 號(hào))。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：病理為直腸腺癌的患者；(2)無(wú)嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，無(wú)全身性嚴(yán)重疾病；(3)未同時(shí)接受免疫治療的患者；(4)MSS(microsatellite stable，微衛(wèi)星穩(wěn)定)基因檢測(cè)未檢測(cè)到MSI-H(microsatellite instability-high，高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定)；(5)無(wú)其他腫瘤以及放療前CT、MRI 等各項(xiàng)影像學(xué)檢查提示未見(jiàn)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移；(6)按照術(shù)前(已行手術(shù)患者)或放療前(未行手術(shù)患者)定位掃描時(shí)MRI 分期，選擇TNM 分期為Ⅱ-Ⅲ期的患者；(7)自愿參加并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者；(2)曾合并其他惡性腫瘤的患者；(3)同時(shí)接受慢性系統(tǒng)性免疫治療的患者；(4)患者依從性差，不能配合完成本研究的信息采集。

1.3 治療方案

1.3.1 方案推薦 局部進(jìn)展期直腸癌患者現(xiàn)推薦行“新輔助放化療+手術(shù)”或“手術(shù)+術(shù)后輔助放化療”，采用6Mv-X 線(xiàn)IMRT(intensity-modulated radiation therapy，適形調(diào)強(qiáng)放療)治療，給予全盆腔照射，劑量分割方式有兩種，25 Gy/5f/1 周和50 Gy/25f/5 周。

1.3.2 靶區(qū)勾畫(huà) (1)術(shù)前靶區(qū)定義：GTVnd(lymph node gross tumor volume，陽(yáng)性淋巴結(jié)大體腫瘤體積)包含直腸MRI/盆腔CT 顯示的直腸系膜區(qū)、骶前區(qū)、髂總、髂內(nèi)、閉孔以及髂外大于1 cm 的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和癌結(jié)節(jié)。CTVp(primary tumor CTV，原發(fā)腫瘤臨床靶區(qū))特指原發(fā)灶的臨床靶區(qū)，包括原發(fā)灶頭腳方向外擴(kuò)2 cm 的范圍。CTV(clinical target volume，臨床靶區(qū))為包括高危淋巴結(jié)引流區(qū)，部分髂總、髂內(nèi)、髂外(下界到股骨頭出現(xiàn)水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區(qū)以及腹股溝淋巴引流區(qū)(視患者具體情況確定是否包括)，PTV(plan target volume，計(jì)劃靶區(qū))在CTVp 和CTV 基礎(chǔ)上前后左右外放0.5～0.7 cm。(2)術(shù)后靶區(qū)定義：包括瘤床、吻合口[經(jīng)腹直腸癌切除術(shù)(Dixon 術(shù))]、會(huì)陰瘢痕(腹會(huì)陰聯(lián)合直腸癌根治術(shù)(Miles 術(shù))、術(shù)后高危淋巴結(jié)引流區(qū)及高危復(fù)發(fā)區(qū)，部分髂總、髂內(nèi)、髂外(下界到股骨頭出現(xiàn)水平)、閉孔、骶前、直腸系膜區(qū)以及腹股溝淋巴引流區(qū)，PTV 在CTV 基礎(chǔ)上前后左右外放0.5～0.7 cm。正常組織限量：膀胱V50＜50%，小腸V50＜10%、最大劑量小于52 Gy，股骨頭V50＜5%。

1.3.3 具體方案 本研究根據(jù)患者個(gè)體化情況，治療方案分為3 種：(1)術(shù)前短程大分割放療(放療后7～10 d 行手術(shù))(2)術(shù)前常規(guī)分割放療同步化療(放療后4～6 周行手術(shù))(3)術(shù)后常規(guī)分割放療同步化療(術(shù)后4 周至6 周行放療)。同步化療方案為卡培他濱(正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司/上海羅氏制藥有限公司產(chǎn))化療(卡培他濱劑量根據(jù)患者體表面積計(jì)算，用量為825 mg/m2，1 日2 次，每周第1 天至第5 天服用)。

1.4 檢測(cè)方法 于研究對(duì)象實(shí)施第1 次放療前1天、放療計(jì)劃結(jié)束后1 天及放療結(jié)束后1 月抽取患者靜脈血2 mL，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T細(xì)胞亞群的占比，采用三激光10 色法，檢測(cè)患者血清T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比、Treg 細(xì)胞占CD4+T 細(xì)胞百分比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)。主要數(shù)據(jù)為多時(shí)點(diǎn)觀測(cè)計(jì)量資料，以描述，組間比較為單因素重復(fù)測(cè)量方差分析+組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)間兩兩比較差值t 檢驗(yàn)。 P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血免疫功能指標(biāo)變化 患者外周血T 淋巴細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞及NK 細(xì)胞絕對(duì)值放療結(jié)束時(shí)較放療開(kāi)始時(shí)下降，放療結(jié)束后1 月較放療結(jié)束時(shí)絕對(duì)值升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。PLR 放療結(jié)束時(shí)較放療前升高，放療結(jié)束后1 月較放療結(jié)束時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

2.2 相關(guān)性分析 Treg 細(xì)胞與PLR 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.453，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。NK 細(xì)胞與PLR 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.545，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。T 淋巴細(xì)胞與PLR 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.604，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。CD4+T細(xì)胞與PLR 的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.592，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.3 隨訪(fǎng)結(jié)果 截止至2020 年1 月，僅有4 例患者出現(xiàn)病情進(jìn)展，各項(xiàng)指標(biāo)與無(wú)進(jìn)展組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)(P ＞0.05)。

3 討論

目前直腸癌個(gè)體化精準(zhǔn)治療模式仍在不斷探索中，荷蘭的NICHE 研究[4]、checkmate 142 研究[5]等現(xiàn)在正在進(jìn)行的研究都表明了免疫治療對(duì)于提高患者直腸癌的緩解率有較大作用。近年來(lái)，直腸癌治療領(lǐng)域除了放療、手術(shù)、化療和靶向治療[6]，已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。本研究選擇LARC 患者，采集患者放化療期間外周血，通過(guò)觀察、了解T 細(xì)胞亞群及NK 細(xì)胞等的變化，尋找免疫細(xì)胞在放射治療模式中的作用機(jī)制，并尋找新的能在直腸癌治療策略中評(píng)估預(yù)后、防止不良事件發(fā)生的特異性指標(biāo)。

腫瘤微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)[7]，T 淋巴細(xì)胞作為細(xì)胞免疫中重要的一環(huán)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有著不可或缺的作用[8-9]。本研究中LARC 癌患者T 淋巴細(xì)胞絕對(duì)值、CD4+T 細(xì)胞絕對(duì)值于放療結(jié)束后到結(jié)束后1 月時(shí)免疫功能有一定回升的趨勢(shì)，一定程度證明了放射治療結(jié)束后患者免疫能力得到恢復(fù)。臨床上可通過(guò)T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)來(lái)了解直腸癌患者機(jī)體免疫系統(tǒng)情況，為預(yù)后的預(yù)測(cè)以及治療方案選擇提供新思路。

在腫瘤微環(huán)境中，Treg 細(xì)胞占正常人外周血及脾臟組織中的CD4+T 細(xì)胞的5%～10%[10-11]。細(xì)胞缺乏或細(xì)胞功能障礙是惡性腫瘤患者自身免疫紊亂的原因[12-13]，因此，它們是設(shè)計(jì)誘導(dǎo)或消除自身和非自身抗原的免疫耐受的良好靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明LARC 患者外周血Treg 細(xì)胞絕對(duì)值放療結(jié)束時(shí)較放療前下降，放療結(jié)束后1 月較放療結(jié)束時(shí)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。以上結(jié)果一定程度上提示放療結(jié)束后的一段時(shí)間，LARC 患者T淋巴細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、Treg 細(xì)胞有增長(zhǎng)趨勢(shì)，Treg細(xì)胞高浸潤(rùn)對(duì)患者預(yù)后的改善有一定價(jià)值。Treg 細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可調(diào)控腫瘤細(xì)胞以及腫瘤的微環(huán)境，引起腫瘤免疫逃逸，影響腫瘤的形成、侵襲和轉(zhuǎn)移[14]，假設(shè)將Treg 細(xì)胞來(lái)源的外泌體作為治療的手段，放療后增高的Treg 細(xì)胞數(shù)目可以增加免疫治療的靶點(diǎn)，從而改善預(yù)后。

NK 細(xì)胞是一種大顆粒淋巴細(xì)胞，相對(duì)于T 細(xì)胞，其通過(guò)激活和抑制細(xì)胞表面受體的信號(hào)，誘發(fā)快速的抗腫瘤反應(yīng)[15-16]。本研究中放療結(jié)束后1 月時(shí)NK 細(xì)胞較放療結(jié)束時(shí)明顯升高，一定程度上表明直腸癌患者治療后體內(nèi)免疫系統(tǒng)被調(diào)動(dòng)，為臨床提供了新思路：臨床上是否可應(yīng)用治療方式增強(qiáng)其體內(nèi)免疫系統(tǒng)活性以達(dá)到改善抗腫瘤反應(yīng)的作用。

PLR 是綜合反映全身炎性反應(yīng)和免疫系統(tǒng)功能的關(guān)鍵指標(biāo)之一。有文獻(xiàn)通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物以及炎性指標(biāo)指出PLR 的升高提示直腸癌患者可能已經(jīng)存在遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[17]，且比值升高與患者生存期呈負(fù)相關(guān)[18]。本研究中PLR 放療結(jié)束時(shí)較放療前、放療結(jié)束后1 月較放療前升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，放療結(jié)束后1 月較放療結(jié)束時(shí)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。放療結(jié)束時(shí)較放療前比值升高，考慮可能為直腸癌患者同步放化療期間，出現(xiàn)的骨髓抑制對(duì)PLR 的升高產(chǎn)生一定程度上的影響。放射治療計(jì)劃結(jié)束后由于放療具有遠(yuǎn)隔效應(yīng)，從而使放療結(jié)束后比值成下降趨勢(shì)，提示放療影響了患者的免疫功能。本研究中對(duì)比LARC 患者治療前的T 細(xì)胞亞群絕對(duì)值和PLR 比值，兩者為負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明在腫瘤微環(huán)境中，免疫和炎癥系統(tǒng)有著相互制衡的關(guān)系。

表1 接受放射治療的直腸癌患者放療前后免疫指標(biāo)變化()

表1 接受放射治療的直腸癌患者放療前后免疫指標(biāo)變化()

注：與放療前比較，aP ＜0.05；與放療結(jié)束時(shí)比較，bP ＜0.05

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)局部進(jìn)展期直腸癌放療前與放療結(jié)束時(shí)、放療前與放療結(jié)束后1 月免疫細(xì)胞變化一定程度上提示放療調(diào)動(dòng)了細(xì)胞免疫，可以進(jìn)一步改善患者的預(yù)后。PLR 圍放療期比值改變提示放療可能通過(guò)改善患者的免疫功能來(lái)延長(zhǎng)患者的生存期。T 細(xì)胞亞群檢測(cè)聯(lián)合炎癥指標(biāo)作為非侵入型手段，目的是篩選高獲益人群，提高治療的個(gè)體化以及精準(zhǔn)化，預(yù)測(cè)療效性預(yù)后。