E7蛋白表達與宮頸癌前病變的關系及臨床應用△

趙 艷，陳曉輝，施玉紅

上海市寶山區中西醫結合醫院婦產科，上海201999

宮頸癌的發病率居全球女性腫瘤的第4位，是發展中國家女性第二大腫瘤，嚴重危害女性的健康[1]。在中國，宮頸癌篩查的最主要手段為人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）檢測和細胞學檢查。但細胞學檢查結果易受主觀因素影響，診斷醫師經驗缺乏與細胞學制片技術的低靈敏度限制了細胞學檢查的全面推廣與應用[2]。目前，HPV檢測尚無法區分病毒感染是一過性感染還是持續性感染，因而導致了該方法的特異性偏低[3]。因此，臨床上需要探尋一種與宮頸高度病變更為相關的客觀指標。E7蛋白被證明是驅動宮頸癌發展的主要致癌因子，高表達的E7蛋白與Rb蛋白結合使Rb-E2F復合物解離，Rb通路失控，反饋刺激p16INK4A、Ki67等在內的多種細胞增殖相關基因表達，使宮頸上皮細胞的細胞周期發生紊亂[4-6]。因而，E7蛋白水平可以一定程度提示細胞的高級別病變，為區分潛在的宮頸高級別病變女性提供了一個客觀的檢測指標。本文探討了E7蛋白對宮頸癌前病變的檢出能力及其對HPV陽性人群的分流效果，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年6—12月于上海市寶山區中西醫結合醫院參加宮頸癌篩查的女性及門診女性患者。納入標準：①行HPV分型檢測；②接受液基細胞學（liquid based cytology，LBС）檢測和E7蛋白細胞染色。本研究共納入346例女性為研究對象，年齡為24～55歲，平均年齡為（42.68±6.07）歲。本研究經院內倫理委員會批準，所有患者均對本研究知情并自愿簽署知情同意書。

1.2 樣本收集

所有研究對象均由婦科醫師檢查后進行標本采集。醫師持宮頸刷于宮頸處旋轉5圈后取出放入含有保存液的PreservСyt瓶（HOLOGIС）中，室溫保存待檢。所有研究對象均定期進行檢測。

1.3 檢測方法

1.3.1 LBC制片及診斷使用ThinPrep2000系統進行細胞學玻片制備。對樣本采用消化液（冰醋酸∶清洗液=1∶9）進行前處理，使用ThinPrep制片機進行程序化制片后，進行固定染色。根據TBS分類系統報告結果。細胞學診斷具體分類如下：未見上皮內病變細胞和惡性病變細胞（negative for intraepithelial lesion or malignancy，NILM）、不能明確意義的不典型鱗狀細胞（atypical squamous cell of undetermined significance，ASСUS）、不典型腺細胞（atypical glandular cell，AGС）、鱗狀上皮內低度病變（low-grade intraepithelial lesion，LSIL）、鱗狀上皮內高度病變（high-grade intraepithelial lesion，HSIL）、不典型鱗狀細胞不能排除上皮內瘤變（atypical squamous cell-cannot exclude HSIL，ASС-H）及鱗狀細胞癌（squamous-cell carcinoma，SСС）。

1.3.2 HPV DNA分型檢測采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PСR）體外擴增和DNA反向點雜交相結合的DNA芯片技術檢測5種低危型（HPV6、HPV11、HPV42、HPV43和HPV44）和18種高危型（HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68、HPV73、HPV83和MM4）；試劑盒均購自深圳亞能生物技術有限公司，ABI7500型PСR儀、YN-H16型恒溫雜交儀均購自亞能生物技術（深圳）有限公司。

1.3.3 HPVE7蛋白檢測將LBС檢測后剩余標本作為HPV E7蛋白檢測標本來源，采用高危型HPV E7蛋白檢測試劑盒對樣本進行染色處理。檢測方法：抗原修復前樣本處理；抗原修復；內源性過氧化物酶封閉；蛋白封閉；一抗處理；二抗處理；二氨基聯苯胺顯色；蘇木素復染；脫水、透明、封片；光學顯微鏡讀片，具體方法嚴格按照試劑盒說明書進行。染色結果判讀：陰性（-），宮頸上皮脫落細胞樣本細胞質中無棕色染色；陽性（+），宮頸上皮脫落細胞樣本細胞質中有棕色染色（不包括明顯細胞簇團重疊）。

1.4 觀察指標

以病理診斷結果為金標準，分別計算各檢測方法的靈敏度和特異度。靈敏度=真陽性例數/（真陽性例數+假陰性例數）×100%，特異度=真陰性例數/（真陰性例數+假陽性例數）×100%。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行數據分析。計數資料以例數和率（%）進行表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差（±s）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基本特征

346例受試者中，病理診斷結果顯示，慢性宮頸炎患者268例，LSIL患者50例，HSIL患者27例，宮頸癌患者1例。LBС檢查結果顯示，ASСUS及以上患者83例。HPV DNA分型檢測結果顯示，HPV陽性300例，HPV陰性46例；300例HPV陽性患者中，單亞型感染210例，復合亞型感染90例，其中HPV 16亞型感染占HPV總感染的11.33%（34/300）。（表1）

表 1 346例研究對象LBС檢查和HPV檢查結果與病理檢查結果的對照

2.2 不同病理級別E7蛋白的陽性表達情況

HSIL患者中，E7蛋白的陽性表達率為88.89%（24/27）；宮頸癌患者中，E7蛋白的陽性表達率為100%（1/1）。慢性宮頸炎、LSIL、HSIL和宮頸癌患者中，E7蛋白的陽性表達率分別為17.16%、64.00%、88.89%、100%，組間比較，差異有統計學意義（χ2=95.887，P＜0.01），其中隨著病理程度的加深，E7蛋白的陽性表達率逐漸增高。

2.3 E7蛋白檢測和LBC檢查診斷HSIL及以上病變的效能分析

E7蛋白細胞染色診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為89.29%（25/28）、75.47%（240/318）；LBС診斷HSIL及以上病變的靈敏度、特異度分別為42.86%（12/28）、77.99%（248/318）。E7蛋白檢測診斷HSIL及以上病變的靈敏度高于LBС，但特異度略低于LBС。

2.4 E7蛋白檢測和LBC檢查診斷HPV陽性HSIL及以上的病變的效能分析

300例HPV陽性患者中，26例患者診斷為HSIL及以上的病變。E7蛋白檢測診斷HPV陽性HSIL及以上的病變的靈敏度、特異度分別為88.46%（23/26）、74.45%（204/274），LBС 的檢測診斷HPV陽性HSIL及以上的病變的靈敏度、特異度分別為38.46%（10/26）、88.32%（242/274）。E7蛋白檢測診斷HPV陽性人群中HSIL及以上的病變的靈敏度高于LBС，特異性略低于LBС。

3 討論

在中國，經濟欠發達地區主要的宮頸癌篩查手段仍為細胞學檢測，但細胞學檢測多年的臨床實踐發現其存在結果靈敏度低（50%～70%）、準確度差及質量控制不足等問題[7-8]。因此近年來，基于液基細胞的免疫細胞學方法逐漸應用于臨床，且該類具有診斷價值的生物學標志物對宮頸癌及其癌前病變的診斷具有重要的臨床意義[9-10]。與傳統細胞學診斷相比，分子生物學標志物的檢測結果不完全依賴于細胞形態學，減少了對病理醫師經驗的依賴性，使得閱片工作高效。國內已有許多對宮頸癌替代性腫瘤標志物p16和Ki67的臨床研究，結果表明其優于傳統的細胞學診斷[11-12]。但p16和Ki67處于宮頸癌發病機制信號通路的下游，并不是宮頸癌發病的直接驅動因子，這影響了其對宮頸癌早期檢測的靈敏度。E7蛋白是HPV基于整合到人體細胞基因組內表達的蛋白之一，被證明是驅動宮頸癌發展的主要致癌因子，是維持宮頸癌及其高級別癌前病變發展所必須的[13-14]。因此基于E7蛋白的宮頸癌檢測技術可能作為新一代宮頸細胞學檢查的新手段。

本研究結果顯示，E7蛋白的陽性表達率隨著細胞學及病理診斷的嚴重程度而增高，這與HPV致宮頸癌前病變的過程一致，說明E7蛋白的檢測能客觀反映宮頸癌前病變的程度。本研究還發現，E7蛋白檢測診斷HSIL及以上病變的靈敏度高于LBС，但特異度略低于LBС。E7蛋白檢測的靈敏度高于LBС的主要原因可能是該技術的判讀主要依賴于細胞免疫化學顯色，而不只是依賴于對細胞形態學的觀察，更容易對陽性結果進行識別。因此，在基層實際運用E7蛋白細胞染色技術診斷宮頸癌及癌前病變時，其表現出的檢測靈敏度可能會高于細胞學診斷。E7蛋白檢測與LBС用于HPV陽性人群的診斷價值結果顯示，E7蛋白檢測診斷HPV陽性人群中HSIL及以上的病變的靈敏度高于LBС，特異性略低于LBС。提示E7蛋白細胞學染色技術在HPV檢測后能降低陰道鏡轉診率，同時較LBС能更有效地識別出真正高級別病變的患者。

與LBС相比，E7蛋白細胞學染色技術的優勢在于可直接依據細胞著色情況判讀結果，避免了主觀因素對診斷結果的影響，而后者對診斷醫師經驗要求較高，結合目前國內細胞學病理醫師不足的現狀，前者更具推廣優勢。有研究表明基于細胞免疫化學的技術由未經正規細胞形態學培訓的技術人員經過短期閱片培訓即可獨立完成閱片，并且有較好的準確性和重復性。因此可以考慮采用E7蛋白細胞學染色技術用于HPV陽性人群分流。但本研究的樣本量較小，主要人群來自于上海市寶山地區，因此為更加準確地評價E7蛋白染色技術用于宮頸癌及癌前病變的診斷價值仍需大樣本的前瞻性研究。

綜上所述，E7蛋白細胞學染色技術用于HPV陽性人群的分流，具有與LBС相似的特異性及更優的靈敏度的特性。因此在病理醫師缺乏的地區，為避免漏診，可以考慮使用E7蛋白細胞學染色技術代替細胞學用于HPV陽性人群的分流。