橄欖油抗氧化性能及抗氧化活性物質的研究

2020-06-07 02:23:58向方桃李書華陳封政

樂山師范學院學報 2020年4期

向方桃，李書華，陳封政,c※

(樂山師范學院 a.校醫院；b.化學學院；c.樂山特色農產品藥用成分研發工程中心，四川樂山 614000)

0 引言

油橄欖鮮果經過清洗，在室溫條件下直接壓榨出果汁，果汁經油水分離得到橄欖油。橄欖油是地中海區域居民膳食結構中的重要組成部分，對降低當地居民的心血管疾病和癌癥的發病率做出了重要貢獻[1]。橄欖油含有70%左右的油酸，其所含有的油酸、亞油酸和亞麻酸的比例近似母乳，這種組成為其贏得了“食用植物油皇后”美譽。近年來的研究表明橄欖油還具有多種生理功能：其高含量的油酸對血液中的膽固醇具有雙向調節作用，能減輕血管粥樣硬化，降低心腦血管梗塞的風險[2]；含有多種脂溶性維生素，且油性溫和，可直接用于皮膚美容或作為護膚品的基質油[3]；所含的類胡蘿卜素、角鯊烯等弱極性物質是橄欖油在低溫甚至常溫下避光保存較長時間不變質的主要因素，這些物質具有抗衰老的作用[4]。前人的研究主要集中在橄欖油的組成、功效以及活性成分的研究[5-7]，尚無直接研究橄欖油的抗氧化性能。基于此，本文研究橄欖油的抗氧性，探索橄欖油中的抗氧化物質，并分離鑒定之，探明橄欖油的抗氧化因子。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：橄欖油由四川天源油橄欖有限公司提供；維生素C，購自上海源葉生物科技有限公司；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)購自北京中生瑞泰科技有限公司。

儀器：RE-2000A旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)，電子天平(上海越平科學儀器有限公司)，分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)，Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 橄欖油的抗氧化性能測定

根據參考文獻[8]，采用DPPH自由基清除的方法，研究橄欖油的抗氧化性能，并以維生素C為陽性對照。考慮到橄欖油在甲醇中的溶解度不好，而在分光光度法測定過程中采用的波長是517 nm，故將溶劑改成丙酮，這樣既能很好地解決橄欖油的溶解度，又因為丙酮的極限波長為330 nm，遠小于517 nm，而不影響試驗的測定。

1.2.2 橄欖油中抗氧化物質的提取與分離

橄欖油的成分主要為油酸，其次為亞油酸和亞麻酸等，極性較弱，而橄欖油中的微量成分，如類胡蘿卜素、角鯊烯等弱極性的物質已有研究，因此，本文主要關注橄欖油中極性略大的抗氧化物質。

取1000 mL橄欖油，用1000 mL石油醚溶解，轉入分液漏斗中，然后加入1000 mL的乙腈，搖勻，靜置分層，放出下層乙腈層；再次向分液漏斗中加入1000 mL乙腈振搖，靜置分層，放出下層乙腈層。合并兩次的乙腈萃取液，用旋轉蒸發儀在60 ℃條件下減壓濃縮，得到橄欖油的乙腈萃取物21 g。

稱取210 g薄層層析硅膠H，用二氯甲烷濕法裝填層析柱。將橄欖油的乙腈萃取物21 g用20 mL丙酮溶解，然后滴加到裝有10 g硅膠的蒸發皿中，然后將蒸發皿置于60 ℃的水浴鍋上加熱，丙酮揮發，橄欖油的乙腈萃取物則吸附在硅膠上。將吸附了樣品的硅膠小心地裝填在硅膠柱上，然后用二氯甲烷/甲醇(40∶1)的混合液300 mL為洗脫液，逐漸階梯式增大洗脫液的極性，依次用二氯甲烷/甲醇(35∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(30∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(25∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(20∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(15∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(10∶1)300 mL、二氯甲烷/甲醇(8∶1)300 mL洗脫層析柱；洗脫液按照每30 mL收集1瓶，合計得到80瓶洗脫液。將每瓶洗脫液通過硅膠薄層板點板層析，層析條件為二氯甲烷/甲醇(10∶1)，顯色劑為95%的硫酸乙醇溶液，加熱顯色。合并顯色相同的組分，收集顯色為單一斑點的組分，濃縮，得到純品化合物18 mg。

1.2.3 橄欖油中抗氧化物質的結構鑒定

將1.2.2中得到的純品化合物以氘代甲醇為溶劑，用Varian INOVA 400核磁共振譜儀進行核磁測試；通過核磁共振氫譜和碳譜圖解析化合物的結構。

1.2.4 橄欖油中抗氧化物質的抗氧化性能測定

將1.2.2中得到的純品化合物按照1.2.1的方法，采用DPPH自由基清除法，以維生素C為陽性對照，研究該純品化合物的抗氧化性能。

1.2.5 數據分析

在1.2.1橄欖油的抗氧化性測定試驗及1.2.4橄欖油中抗氧化物質的抗氧化性能測定中，均以維生素C為陽性對照，以空白作為分光光度計調零，做三組重復試驗，抗氧化性能取三組試驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 橄欖油對DPPH自由基的清除試驗

以維生素C為陽性對照，不同濃度的橄欖油對DPPH自由基清除率見表1。

表1 橄欖油對DPPH自由基的清除率

由于橄欖油的主要成分是油，抗氧化能力可能不強，故其濃度盡管設定很高，但抗氧化活性物質含量卻不高。表1的結果印證了這種推測：橄欖油對DPPH自由基有一定的清除能力，但其抗氧化能力較弱。

2.2 橄欖油中抗氧化物質的結構鑒定

將得到的純品物質以氘代甲醇為溶劑，通過核磁共振儀測試，得到該化合物的核磁共振氫譜圖(圖1)和核磁共振碳譜圖(圖2)。通過核磁共振氫譜可以看出該化合物氫原子的信號：δ6.70(1H，d，J=8Hz，H-5)，δ6.67(1H，s， H-1)，δ6.55(1H，d，J=8.0，H-6)，根據這3處H信號推測該化合物含有一個苯環，苯環上有3個氫原子，其中一個氫原子無裂分，另外兩個氫原子則相鄰；由δ3.69(2H，t，J=8Hz，H-7)和δ2.68(2H，t，J=8Hz，H-8)推測出該化合物含有一個 - CH2CH2O-片段。

圖1 化合物的核磁共振氫譜

通過核磁共振碳譜可以看出該化合物碳原子的信號為δ131.7(C-1)，116.3(C-2)，146.1(C-3)，144.6(C-4)，117.1(C-5)，121.2(C-6)，39.6(C-7)，64.6(C-8)；化學位移在100～150 PPM范圍有6個碳信號為131.7, 116.3, 146.1, 144.6, 117.1, 121.2；這6個碳信號為SP2雜化碳，由這6個碳原子組成了一個苯環；由化學位移在δ39.6處的C和64.6處的碳信號推測該化合物有- CH2CH2O-片段。