HPLC法測定原料藥AL58805中基因毒雜質

朱小華 呂列超 趙金亮 劉巧云 夏 玥 張 迪

(1.常州佳德醫藥科技有限公司，江蘇 常州 213164；2.常州工程職業技術學院，江蘇 常州 213164)

AL58805[1]是1類分子靶向抗腫瘤創新藥物，已獲得了國家食品藥品監督管理總局頒發的臨床試驗批件(批件號2017L15180 和2017L05181)，目前已進入臨床研究[2]。AL58805進入人體后，會選擇特定的致癌位點來發揮作用，使腫瘤細胞產生特異性死亡，而不會波及周圍的正常組織細胞。通過抑制腫瘤信號通路，對特定腫瘤有顯著的治療作用，為癌癥患者帶來了新的希望[3]。由于AL58805為對甲苯磺酸鹽，在合成中使用了有機溶劑甲醇和乙醇，有可能會反應生成潛在基因毒雜質對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯[4]，因此建立對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯的測定方法很有必要。

目前，對甲苯磺酸酯類的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、液質聯用法[6-8]、氣質聯用法[9-10]等。高效液相色譜法具有低成本、分離效率快、靈敏度高、適用于熱不穩定化合物等優點。本研究建立了HPLC法測定AL58805原料藥中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯含量的方法，可為該藥有害雜質的檢測提供參考。

AL58805制劑臨床服藥劑量約為150 mg·d-1，根據EMA《遺傳毒性雜質限度指導原則》規定的限度，每人不能超過1.5 μg·d-1，則得到AL58805原料藥中對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯的標準限度均為10 ppm[11]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器。

1.2 試劑

AL58805原料藥(常州佳德醫藥科技有限公司，批號：20150501、20150601、20150701)；MPTS(對甲苯磺酸甲酯，阿拉丁，含量98.0%，批號E1528080)；EPTS(對甲苯磺酸乙酯，阿拉丁，含量98.0%，批號H1524007)；乙腈(色譜純)；磷酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；水。

2 方法

2.1 色譜條件

InertSustain C18色譜柱(4.6×250 mm,5 μm)；流動相：0.015 mol·L-1磷酸水溶液-乙腈(50∶50，V/V)；檢測波長為225 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為20 μL；洗脫時間為18 min；溶劑為乙腈-水(50∶50，V/V)。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備

精密稱取MPTS對照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為對MPTS貯備液。另精密稱取EPTS對照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，作為EPTS貯備液。分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各10 μg的混合溶液作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，加溶劑稀釋制成每1 mL中約含MPTS、EPTS各100ng的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

取AL58805原料藥約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加適量溶劑溶解后，用1 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節pH至9，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，超聲10 min，于0℃析晶30 min后，取出強力振搖，靜置60 min后，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

3 結果

3.1 波長選擇

精密量取對照品貯備液20 μL注入液相色譜儀，在200～400 nm的波長范圍進行PDA掃描。結果顯示，MPTS和EPTS在225nm處有最大吸收，因此選擇225 nm作為檢測波長。

3.2 專屬性試驗

對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各取 20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示，AL58805、MPTS、EPTS完全分離，保留時間分別為6.340、10.733、14.038 min，空白溶液對MPTS、EPTS的測定無干擾，說明本色譜條件專屬性良好。

3.3 穩定性試驗

精密量取新鮮制備的對照品溶液20 μL，分別于0、3、7、10、17、24 h 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果顯示，MPTS、EPTS的RSD 分別為3.8%、3.7%。結果表明，對照品溶液24 h 內穩定性良好。

3.4 定量限和檢測限

分別精密量取MPTS、EPTS貯備液適量，采用逐步稀釋法，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄信噪比(S/N)約為10和3時的色譜圖。測得MPTS、EPTS的定量限(S/N≈10)分別為9.960、13.64 ng·mL-1，檢測限(S/N≈3)分別為3.320、4.550 ng·mL-1。

3.5 線性范圍

精密量取MPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為3.320、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液；另精密量取EPTS貯備液適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為4.550、30、60、100、150、200 ng·mL-1的線性系列溶液；分別精密量取 20 μL注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。以濃度(ng·mL-1)為橫坐標X，峰面積為縱坐標Y，進行線性回歸。求得回歸方程分別為MPTS:Y=0.0638X+0.0029，R2=0.9997；EPTS:Y=0.0623X+0.0456，R2=0.9992。線性范圍分別為EPTS:3.320～200 ng·mL-1；MPTS:4.550～200 ng·mL-1。

3.6 精密度試驗

3.6.1重復性

精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液0.10 mL，置10 mL量瓶中，共量取6份，加入已知MPTS、EPTS含量的待測原料藥AL58805約100 mg，加適量溶劑溶解，按“2.2.2”項下處理，取續濾液作為重復性試驗溶液。分別精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。結果表明，MPTS、EPTS的回收率分別為105.8%、99.0%，RSD分別為1.2%、2.3%。

3.6.2中間精密度

更換儀器和日期，按“3.6.1”項下重新配制6份試樣溶液進行檢測。中間精密度與重復性試驗12次結果表明，MPTS、EPTS的回收率分別為106.5%、92.5%，RSD分別為1.2%、7.6%。結果表明，該方法具有良好的精密度。

3.7 加樣回收率

分別取已知MPTS、EPTS含量的原料藥AL58805約100 mg，置10 mL量瓶中，依次加入“2.2.1”項下對照品貯備液0.07，0.10，0.13 mL各3份，加適量溶劑溶解，按“2.2.2”項下處理，制成低、中、高濃度的回收率溶液。精密量取各回收率試驗溶液和對照品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄MPTS、EPTS的峰面積。計算MPTS、EPTS在供試品中的回收率分別為92.1% 、101.4%，RSD均為2.8%。結果見表1、表2。

3.8 耐用性試驗

采用了“2.1”項下的方法，適量調整了色譜條件參數(柱溫、流速、色譜柱品牌)，精密量取供試品溶液和對照品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果表明，本法具有良好的耐用性。

表1 回收率試驗結果(MPTS，n=9)

表2 回收率試驗結果(EPTS，n=9)

3.9 樣品含量測定

取AL58805原料藥，按“2.2”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，分別精密量取供試品溶液和對照品溶液各20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算AL58805原料藥中MPTS、EPTS的含量。結果顯示，三批供試品中均未檢出MPTS、EPTS，圖譜見圖1。

A：對照品溶液，B：供試品溶液圖1 典型色譜圖Fig. 1 TypicalChromatograms

4 討論

由于本方法中供試品濃度較高，故增加了樣品前處理步驟(溶解、析晶、過濾等)，從而大大降低了進樣溶液中供試品濃度，減少高濃度樣品溶液對雜質測定的干擾。

綜上所述，本文建立的采用HPLC法測定原料藥AL58805中基因毒雜質對甲苯磺酸甲酯、對甲苯磺酸乙酯，方法具有成本低廉、靈敏度高，操作簡單等優點，可以為原料藥AL58805的質量標準的建立提供參考。