環糊精對煙草浸提液濃縮過程中化學成分揮發性的影響

郭 洋，王相凡，李學紅*，于國強，丁紅營，楊 峰，許紅濤

1.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道136 號 450001

2.河南卷煙工業煙草薄片有限公司技術中心，河南省許昌市金葉大道666 號 461000

造紙法再造煙葉是將煙草原料（如煙末、碎煙片、片煙、煙梗等）進行水浸提，將不溶物經造紙工藝制成薄片，將浸提液濃縮后涂布于薄片上而制成的均質化再造煙葉［1-5］。在再造煙葉工藝中，浸提液的真空濃縮過程會導致一定煙草化學成分揮發，從而影響再造煙葉產品的品質。例如，葉建斌等［6］發現煙草浸提液經濃縮后，一些重要致香成分如糠醛、苯乙醛、大馬酮和二氫獼猴桃內酯等的質量分數明顯降低。李華雨等［7-8］研究表明煙草提取液濃縮過程中平均約30%左右的揮發性致香成分揮發損失，其中羧酸酯類化合物、煙堿和新植二烯分別減少約71.32%、73.15%和54.46%。濃縮時如果真空度低、溫度高，致香成分揮發較大；而濃縮真空度高、溫度低時，則被真空抽走的致香成分量增加［7-8］。因此，如何減少煙草浸提液濃縮過程中化學成分特別是致香成分的損失是再造煙葉生產中面臨的一個重要問題。

環糊精（Cyclodextrin，CD）是一類由D-吡喃型葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵相互連接而成的環狀低聚糖，其分子呈現為一個外表親水的疏水內腔結構，可以將疏水性客體包埋在其空腔內而形成包合物，從而提高客體的穩定性［9-11］。目前已實現商業化的環糊精主要有α-、β-和γ-環糊精（α-、β-和γ-CD）3 種，其中β-CD 價格低廉，應用十分廣泛，而α-和γ-CD 由于有獨特的應用特性，其生產規模也在逐年增長［12］。將環糊精應用于煙草產品進行增香已有不少報道，例如Kobayashi等［13］將香料用環糊精包埋后加入卷煙濾棒中，不僅提高了香料的穩定性，還可改善香氣質量；Zhu 等［14］和Ciobanu 等［15］用β-環糊精包埋煙用香料，提高了香料成分的熱穩定性、延長了煙草的留香時間。截至目前，將環糊精添加至煙草浸提液減少濃縮過程中化學成分損失的研究還鮮見報道。因此，將3 種環糊精（α-、β-和γ-CD）添加至再造煙葉生產中的煙草浸提液中，研究環糊精對浸提液濃縮過程中化學成分揮發的影響，旨在為提高再造煙葉吸食品質開發新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

煙草碎料由河南卷煙工業煙草薄片有限公司提供。

α-、β-和γ-環糊精（98%，山東濱州智源生物科技有限公司）；乙酸苯乙酯（內標，99%，上海麥克林生化科技有限公司）；其他試劑均為分析純，購自中國醫藥集團有限公司。

6890-5973N 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；RE52-99 旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；MP-501A 超級恒溫循環槽（上海一恒科學儀器有限公司）；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（河南省予華儀器有限公司）；同時蒸餾萃取裝置（北京玻璃集團公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草浸提液的制備

稱取200 g 碎煙料，首次加入6 倍質量的去離子水，60 ℃水浴攪拌浸提1 h，8 層紗布過濾，收集浸提液；第二次將殘余物加入4 倍質量的水，再次60 ℃浸提30 min 后過濾；再重復4 倍質量的水浸提，最后將3 次浸提液合并，4 000 r/min 離心10 min，將上清液密封后置于冰箱中冷藏。

1.2.2 添加或不添加環糊精煙草浸提液的濃縮及揮發物的冷凝回收

由于真空濃縮過程的揮發物通過冷凝方法不能被全部回收（大量低沸點成分被抽走），無法對揮發的化學成分進行全面分析，因此本實驗中采用常壓加熱濃縮-冷凝的方法，整個系統處于相對密閉狀態，確保所有揮發的化學成分得以全部收集并分析。具體操作如下：

準確稱取100 g 浸提液于圓底燒瓶中，加入質量分數為1.0%的環糊精，磁力攪拌0.5 h。將加樣燒瓶接入常壓加熱濃縮-冷凝裝置中，磁力攪拌下120 ℃油浴加熱2.5 h［16］［最終濃縮 液濃度約 為（25.5±0.5）波美度］，5 ℃冷卻水循環冷凝，同時冷凝管下端用玻璃導管插入含有水-二氯甲烷混合物（體積比1∶1）的三角瓶中，鋁箔密封瓶口。濃縮完畢且體系冷卻后，先后用蒸餾水和二氯甲烷沖洗冷凝管內壁，收集沖洗液并與三角瓶中液體合并，密封條件下混合攪拌10 min，靜置后分離有機相，水相中再重復加入10 mL 二氯甲烷萃取2 次，合并有機相。

向有機相中加入10 g 無水硫酸鈉干燥過夜，用孔徑為0.45 μm 的有機針式過濾器過濾至濃縮瓶中，40 ℃水浴濃縮至1 mL，準確加入50 μL 乙酸苯乙酯內標后進行GC-MS 分析。GC-MS 測試條件［17-18］：

色譜柱：DB-5MS 毛細管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純He；載氣流速：1.50 mL/min；進樣方式：不分流；進樣量：1 μL；升溫程序：50 ℃（2 min）280 ℃（5 min）；電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；電離能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；質量掃描范圍：50～450 amu；溶劑延遲：5 min。FID 檢測器溫度：250 ℃；氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：450 mL/min；尾吹氣（He）流速：30 mL/min。

利用氣質聯用儀自帶軟件（增強型數據分析化學工作站）對所得質譜結果進行NIST 譜庫檢索識別，并結合一些標準樣品的GC 保留時間、相關文獻中煙草成分的GC 保留時間進行定性分析，選擇匹配度≥75%；以乙酸苯乙酯為內標，用相應的校正因子校準待測組分的峰值并與內標物的峰值進行比較，求出待測組分的質量分數。

分別進行α-CD、β-CD、γ-CD 組以及3 種環糊精混合組的濃縮揮發實驗，同時以不加環糊精組作為對照。單獨環糊精組中α-CD、β-CD 和γ-CD添加量均為1.0%（質量分數，下同），混合組中α-CD、β-CD 和γ-CD 添加量分別為0.25%、0.5%和0.25%。

2 結果與分析

研究環糊精對化學成分揮發性的影響，可以通過分析添加或不添加環糊精時濃縮液中化學成分的種類和質量分數變化來進行，也可以通過分析浸提液濃縮過程中揮發的化學成分的變化來比較。但考慮到濃縮液中部分化學成分是以環糊精包合物的形式存在，不易于定量，因此本實驗中采用后者即收集揮發的化學成分并GC-MS 分析來進行研究。

在前期實驗中，采用83 ℃、0.075 MPa 的參數（模擬實際生產條件）對浸提液進行濃縮、0 ℃冷凝回收化學成分，發現濃縮可導致浸提液中化學成分損失達44.1%，主要集中于揮發性相對較高的52 種化學成分，而0 ℃冷凝只能回收其中約30 種成分，且這些成分的回收量遠低于濃縮過程的損失量。因此，為了確保濃縮過程揮發出的化學成分被全部回收，又采用常壓的半封閉加熱濃縮系統進行實驗。

2.1 單獨加入3 種環糊精對浸提液濃縮過程中化學成分揮發的影響

浸提液經濃縮后回收的揮發物質經GC-MS分析，檢測出的主要化學成分及其質量分數結果見表1。可知，從二氯甲烷萃取液中主要檢測出58 種化學成分，其中酮類20 種、醇類10 種、醛類4種、酯類6 種、酚類3 種、雜環類6 種、酸類3 種、烴類6 種。相對于對照組，在添加量為1%的條件下，3 種CD 均能不同程度地降低濃縮過程中化學成分的揮發。

表1 單獨加入3 種CD 時浸提液濃縮揮發物中化學成分的質量分數Tab.1 Contents of chemical components in volatile components during extraction when adding three CDs separately（μg·g-1)

表1（續1）

表1（續2）

為了更好地分析實驗結果，對表1 中數據進行計算，可得到加入3 種CD 后浸提液濃縮過程中58種化學成分的相對揮發減少量，對照保留時間，結果列于表2。

表2 3 種CD 對浸提液濃縮過程化學成分揮發減少量的影響Tab.2 Effects of three CDs on volatilization of chemical components during extraction and concentration

表2（續1）

由表2 可知，3 種環糊精降低化學成分揮發性的作用存在差異。α-CD 整體降低較少，除了能夠降低小分子酮或醇、α-香附酮、苯甲醛、苯乙醛、苯、有機酸和部分雜環類化合物的揮發外，對其他類型成分的揮發性影響相對較小。β-CD 和γ-CD降低化學成分揮發的量相對較大，影響到的化學成分范圍也相對更大，特別是γ-CD，對大部分化學成分的揮發均有較好的降低作用，在成分范圍方面也寬于α-CD 和β-CD。

為了探索3 種CD 與化學成分出峰時間的關系，以GC-MS 保留時間為橫坐標、3 種CD 條件下浸提液濃縮過程化學成分的揮發減少量為縱坐標作圖，得圖1。

由圖1 并結合表2 可知，γ-CD 降低化學成分揮發明顯，β-和α-CD 相對較弱。具體來說，γ-CD除了對保留時間分別為8.66、8.82、20.45 和26.53 min 的異戊醛、苯、苯酚和芳樟醇沒有效果外，對整個出峰保留時間范圍內的其他化學成分的揮發均有不同影響。β-CD 影響的化學成分范圍也較廣，但總體效果不如γ-CD，其使化學成分揮發減少約19.7%。α-CD 主要對保留時間在8.82～20.14 min 之間的化學成分以及保留時間分別為23.87、54.30、56.13、58.58 和72.62 min 的化學成分有影響，對化學成分揮發的降低程度為19.8%，特別是其對保留時間小于12.83 min 的幾種化學成分的影響，可以與β-和γ-CD 形成互補。

3 種環糊精對煙草化學成分揮發性的影響跟其疏水空腔與客體分子尺寸的匹配度、客體疏水性等因素有關［19-20］。α-CD 的空腔直徑在0.47～0.53 nm 之間，通常只能包埋體積相對較小的分子，而β-CD 和γ-CD 的空腔直徑分別為0.60～0.65 nm 和0.75～0.83 nm，隨著空腔直徑的增大，其所能包埋的客體的分子量范圍也增大。從本實驗結果來看，β-CD 和γ-CD 對煙草化學成分的包埋選擇性不強，而α-CD 則表現一定的分子尺寸選擇性。

2.2 加入3 種環糊精混合物對浸提液濃縮過程中化學成分揮發性的影響

3 種環糊精降低化學成分揮發性的能力依次為γ-CD＞β-CD＞α-CD。但γ-CD 價格較高，實際應用受限，β-CD 成本低廉，在工業領域中應用最廣，α-CD 價格居中且在降低小分子成分揮發方面有一定優勢，三者具有一定程度的互補性。考慮上述因素，初步選擇使用α-CD、β-CD 和γ-CD 添加質量比例為1∶2∶1，結果見表3。

浸提液濃縮后得到的揮發性成分經GC-MS分析，共鑒定出64 種化學成分，其中酮類22 種、醇類12 種、醛類4 種、酯類7 種、酚類3 種、雜環類6種、酸類5 種、烴類5 種。相對于未添加環糊精的對照組，加入1%環糊精混合物，化學成分的揮發量均顯著降低。酮類化合物中3 種低濃度組分9-羥基-4,7-巨豆二烯-3-酮、α-香附酮和螺巖蘭草酮未檢出，可能被CDs 保留在濃縮液中，揮發量減少20.0%～33.3%的有11 種，8.3%～19.4%的有8 種；對于12 種醇類化合物，其中有6 種組分的揮發量減少20.0%～31.6%，3 種組分的揮發量減少10.0%～20.0%，2 種組分的揮發量減少小于10%，低質量分數的鐮葉芹醇在揮發物中未檢出，可能被保留在濃縮液中；對于酯類化合物，二氫獼猴桃內酯和閉鞘姜酯的揮發量分別減少41.4%和35.6%，其余酯類的揮發量減少7.6%～18.2%；6 種雜環類化合物中，除3-（4,8,12-三甲基十三烷基）呋喃揮發量減少61.5%外，其余的減少量在13.2%～25.6%之間；5種有機酸中，低濃度的2-癸烯酸和棕櫚酸未檢出，丁酸、2-甲基丁酸和己酸的揮發量減少分別為25.3%、9.1%和30.3%；另外，醛類和酚類化合物揮發量減少分別在13.9%～26.2%和16.4%～23.8%之間，烴類化合物減少9.3%～26.9%（4,4-二甲基-3-（3-甲基-3-丁烯亞基）-2-亞甲基雙環［4.1.0］庚烷未檢出，八氫-2-（1-甲基亞乙基）-4,7-亞甲基-1H-茚揮發量減少50.0%）。

為了更直觀顯示3 種CD 的混合物對揮發性成分的影響，以化學成分的組分序號為橫坐標，以化學成分的相對揮發減少量為縱坐標進行作圖，得圖2。可知，各數據點的縱坐標值主要分布于10.0%～30.0%之間，說明加入1%CD 混合物后，大多數化合物的相對揮發減少量處于此范圍內，相比單獨加入3 種CD，混合環糊精可以對整體化合物揮發量起到降低效果。

表3 添加3 種CD 混合物對浸提液濃縮過程化學成分揮發減少量的影響Tab.3 Effects of three CDs mixture on volatilization loss of chemical components during extraction and concentration

表3（續1）

圖2 3 種環糊精混合物對各化學成分揮發減少量的影響Fig.2 Effects of three CDs mixture on the volatilization loss of chemical components

3 結論

①向煙草浸提液中添加3 種環糊精可有效降低濃縮過程中化學成分的揮發量，但不同環糊精對各化學成分揮發量的降低程度存在差異。其中，γ-CD 降低作用最強，β-CD 次之，α-CD 的效果最差；γ-CD 和β-CD 對較廣范圍的化學成分有影響，α-CD 對中小分子化合物的影響更為顯著且具有選擇性。②相比于單獨加入3 種環糊精，加入混合環糊精能夠降低化合物的整體揮發量，更有利于煙草化學成分整體揮發量的減少。