豆漿灌根對烤煙生長及土壤細菌群落的影響

戴華鑫，張艷玲，段衛東，陳小龍，蘇新宏，任應斌，劉文濤，李 亮，毛家偉，張 翔*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2.河南中煙工業有限責任公司，鄭州市榆林南路16 號 450000

3.河南省煙草公司三門峽市公司，河南省三門峽市崤山路中段 472000

4.鄭州大學化工與能源學院，鄭州市科學大道100 號 450001

5.河南省農業科學院植物營養與資源環境研究所，鄭州市花園路116 號 450002

豆漿灌根是河南三門峽煙區經過長期生產實踐形成的一種成熟有效的有機肥追施技術，常年推廣面積占本地烤煙種植總面積的90%以上。近年來在洛陽、平頂山、南陽等煙區逐步推廣。傳統豆漿灌根技術包括豆漿制作和田間施用兩部分，將大豆用水浸泡，待大豆發脹后用機器打碎，再密封保存，于太陽下暴曬1 周，充分發酵至發臭，最后根據土壤墑情兌水混勻，澆灌于煙株根部［1］。目前，與傳統豆漿制作方法相比，通過工廠自動化加工生產的酵解豆粕營養豐富、品質穩定，在提高烤煙品質方面取得較好的應用效果［2］。

土壤微生物參與土壤的形成發育、物質循環和肥力演變等過程，是維持土壤質量的重要組成部分［3］。土壤微生物是土壤生態系統中物質循環和能量流動的主要參與者，具有土壤C、N、P 和S循環的“推進器”和土壤養分植物有效性的“轉換器”等多方面功能，其代謝物是植物體所需的營養成分；土壤微生物種群多樣性及優勢菌屬的變化，可在一定程度上反映土壤質量的優劣［4-5］。前人研究發現，傳統豆漿灌根可提高烤煙物理、化學、外觀和感官品質［2］，提高煙葉香氣物質總量［6］，配施其他有機肥能促進烤煙生長發育［7］，提高烤煙感官品質和煙株抗病性［8］。目前，關于豆漿灌根對烤煙的影響研究多集中于提升烤煙質量方面，而豆漿灌根對土壤養分、土壤微生物菌落結構的系統研究較少，尤其是豆漿灌根對土壤細菌數量、群落結構及功能細菌豐度的影響方面尚未見報道。因此，通過盆栽和大田試驗，檢測豆漿灌根前后土壤養分、煙株農藝性狀和根系生長的變化，明確豆漿灌根對土壤細菌數量、群落結構及功能細菌的影響，以揭示其促進烤煙生長和提高煙葉品質的機理，為豆漿灌根這一土壤保育措施的推廣應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

1.1.1 大田試驗

于2017 年在河南省三門峽市盧氏縣杜關鎮選擇土壤肥力中等水平的平整地塊，以當地主栽品種云煙87 為材料，開展豆漿灌根田間試驗。傳統豆漿與酵解豆粕的營養成分見表1。煙苗5 月2 日移栽，種植密度及田間管理按照當地優質煙葉生產技術規范進行，試驗小區的栽培條件一致。煙苗移栽28 d 后進行豆漿灌根，設置3 個處理：分別為清水對照（CK）、傳統豆漿（T1）和酵解豆粕（T2）；傳統豆漿和酵解豆粕的灌根用量均為5 kg/667m2，具體施用方法參考文獻［1］。豆漿灌根后0、5、20、35、55、75 和95 d 采集大田土壤樣品。采用多點混合取樣法采集煙株間壟體0～15 cm 處的土壤，采集10 棵煙株根圍土壤混合成1 個樣品，每處理采集3 個混合樣品。將采集的土壤樣品分為兩部分，一部分立即用無菌封口袋包扎密封，置于干冰中帶回至實驗室于-80℃冰箱中保存，用于土壤DNA 的提取；另一部分裝入布袋，室內自然風干，過2 mm 篩后用于土壤有機質、速效氮、有效磷、速效鉀、有效鐵、交換性鈣、交換性鎂、活性有機碳及土壤蛋白等養分指標的測定。煙株打頂前測定株高、節距、莖圍、留葉數、最大葉長和葉寬等農藝性狀指標，每處理15 次重復。

1.1.2 盆栽試驗

采集河南省三門峽市盧氏縣大田試驗用的煙田土壤，充分混勻過篩后去除石塊等雜質，裝入40 L 塑料盆中。選取六葉一心生長期的云煙87 煙苗，于5 月2 日前移栽，每處理10 盆，每盆3 株，移栽28 d 后進行間苗處理，保留1 株，處理設置同大田試驗。豆漿灌根處理40 d 后，用自來水沖洗煙株根系，待根系上土壤全部被沖掉后，置于WinRHIZO PRO 根系掃描系統（加拿大Regent 公司）中測定根系生長指標，最后放入55 ℃烘箱中烘干稱量。

表1 傳統豆漿與酵解豆粕的營養成分比較Tab.1 Nutrient compositions of traditional soymilk and fermented soymeal （g/kg）

1.2 測定方法

1.2.1 土壤養分含量的測定

采用堿解擴散法測定土壤堿解氮含量（質量分數）［9］；采用NaHCO3浸提—鉬藍比色法測定有效磷含量［9］；采用NH4OAc 浸提—火焰光度法測定速效鉀含量［9］；采用重鉻酸鉀容量法測定土壤有機質含量［9］；采用二乙三胺五乙酸浸提—原子吸收分光光度法測定有效態鐵、交換性鈣和鎂含量［9］。參照康奈爾土壤健康評價中的試驗方法測定土壤蛋白和活性有機碳含量［9］。

1.2.2 土壤細菌多樣性與數量檢測

采用土壤DNA 專用提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation Kit，美國MO BIO Laboratories 公司）提取土壤微生物基因組DNA，將獲得的DNA 樣品置于-20℃冰箱中保存備用。

PCR反應引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′）和926R（5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTT T-3′）。利用膠回收試劑盒（美國Axygen 公司）回收PCR 產物，獲得PCR 擴增目的片段，并連接pMD18-T 載體（日本Takara 公司），轉化感受態細胞，進行PCR 菌落鑒定，對陽性克隆進行測序。根據測序結果，利用質粒提取試劑盒（美國Axygen公司）提取含有目的片段的質粒作為標準質粒，利用Qubit 3.0（美國Invitrogen 公司）測定質粒DNA溶液濃度，并計算標準質粒的拷貝數。通過熒光定量PCR 構建標準曲線。采用FTC-3000TM Real-Time qPCR 系統（上海Funglyn Biotech 公司）定量PCR 儀，SRBR Premix Ex TaqTM（2×）（日本Takara 公司）進行定量分析，結果以目標微生物拷貝數表示。

1.2.3 細菌16S rDNA 序列擴增和MiSeq 測序

選取16S rDNA 的V4～V5 區序列進行高通量測序分析，采用兩步PCR 擴增方法進行文庫構建，MiSeq 測序及序列優化具體步驟參照文獻［10］。

1.3 數據分析

采用97%相似性進行OTU（operational taxonomic unit）聚 類（UPARSE software），OTU 代表序列與SILVA 128 數據庫比對進行物種信息注釋?；诜诸悓W信息，在門、綱、目、科、屬分類水平上進行群落結構的統計分析。利用mothur（Version 1.33.3）進行Chao 物種豐富度和Shannon物種多樣性分析。利用SPSS 19.0 軟件進行單因素方差分析，采用Duncan's 新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 豆漿灌根對大田土壤養分含量的影響

由表2 可知，豆漿（傳統豆漿和酵解豆粕）灌根前，不同處理間各營養元素含量無顯著差異。豆漿灌根初期（5 d），清水處理后的活性有機碳、土壤蛋白含量低于豆漿灌根處理。灌根后20 d，酵解豆粕處理的土壤速效氮、有效磷、速效鉀含量顯著高于對照和傳統豆漿處理，交換性鈣和交換性鎂含量顯著高于對照；豆漿灌根后55、75 和95 d，土壤中的速效氮和有效磷含量顯著高于對照；豆漿灌根后75 d 和95 d，土壤速效鉀含量顯著高于對照。而豆漿灌根對土壤有機質和有效鐵含量無顯著影響。與對照相比，土壤蛋白和活性有機碳含量在豆漿灌根后5 d 和20 d 均顯著升高；在傳統豆漿灌根后35 d 土壤蛋白仍保持較高含量，35 d之后處理間含量無明顯差異。

2.2 豆漿灌根對大田烤煙農藝性狀的影響

由表3 可知，豆漿灌根對大田烤煙株高、節距、莖圍、留葉數、中部葉最大葉寬、上部葉最大葉長等生長指標的影響不大，但傳統豆漿和酵解豆粕處理后中部葉最大葉長分別顯著高于對照1.9 cm和2.1 cm，上部葉最大葉寬顯著高于對照1.6 cm和1.7 cm。因此，豆漿灌根能促進大田烤煙葉片的生長。

2.3 豆漿灌根對盆栽烤煙生長的影響

由表4 可知，與對照相比，豆漿灌根后的盆栽煙株總根長、根表面積、根直徑、單位體積根長、根體積、根干質量等指標均顯著提高。與對照相比，傳統豆漿和酵解豆粕處理后總根長分別提高16.6%和12.8%，根表面積分別提高21.1%和25.1%，根直徑分別提高15.0%和17.4%，單位體積根長分別提高16.8%和13.1%，根體積分別提高27.7%和29.5%，根干質量分別提高16.6%和17.6%。

表2 豆漿灌根對土壤養分含量的影響①Tab.2 Effects of root irrigation with soymilk on soil nutrient contents （mg/kg）

表3 豆漿灌根對大田烤煙農藝性狀的影響Tab.3 Effects of root irrigation with soymilk on agronomic traits of flue-cured tobacco in fields

表4 豆漿灌根對盆栽烤煙根系生長的影響Tab.4 Effects of root irrigation with soymilk on root growth of potted flue-cured tobacco

由表5 可知，與對照相比，豆漿灌根后盆栽煙株的株高和莖圍無明顯變化，煙株留葉數顯著增加；傳統豆漿和酵解豆粕處理后，煙株中部葉及上部葉葉長和葉寬均顯著增加，其中，中部葉最大葉長分別增加2.9 cm 和2.6 cm，葉寬分別增加1.8cm和1.5cm；上部葉最大葉長分別增加2.9 cm 和3.0 cm，葉寬分別增加1.6 cm 和2.1 cm。綜合來看，豆漿灌根能顯著促進烤煙根系及地上部葉片的生長發育。

表5 豆漿灌根對盆栽烤煙地上部生長的影響Tab.5 Effects of root irrigation with soymilk on aerial parts of potted flue-cured tobacco

2.4 豆漿灌根對大田土壤細菌數量的影響

由圖1 可知，豆漿灌根前土壤中細菌數量差異不大；傳統豆漿處理后5 d 和20 d 細菌數量呈上升趨勢，分別為5.59×108cfu·g-1和11.61×108cfu·g-1。酵解豆粕處理后5 d 土壤中細菌數量達到最大值，為9.34×108cfu·g-1，是對照的7.7 倍；豆漿灌根處理后35 d 至95 d 土壤細菌數量呈波動變化，但顯著低于灌根初期；清水對照處理的細菌數量變化不大。

圖1 豆漿灌根對土壤細菌數量的影響Fig.1 Effects of root irrigation with soymilk on number of soil bacteria

2.5 豆漿灌根對土壤細菌多樣性的影響

由表6 看出，各樣品OTU 數目分布在1 107～2 132 之間，序列覆蓋率均達到0.98 以上，說明各樣品文庫中包含了細菌群落的絕大多數細菌類群，基本能反映群落結構組成。傳統豆漿和酵解豆粕處理后5 d 和20 d，細菌OTU 數量顯著下降，表明豆漿（尤其是酵解豆粕）處理短時間內能明顯改變土壤的微生態環境。豆漿灌根后35 d 和55 d，酵解豆粕細菌OTU 數量低于對照；豆漿灌根后75 d細菌OTU 數量顯著高于對照；豆漿灌根后95 d，3個處理間細菌OTU 數量無顯著差異。

由圖2 可知，豆漿灌根后5 d，酵解豆粕處理的Chao 和Shannon 數值顯著低于對照和傳統豆漿。豆漿灌根后35 d 和95 d，3 種處理間土壤細菌Chao 和Shannon 指數無顯著變化。酵解豆粕處理后35 d 和95 d，Chao 和Shannon 指數無顯著變化。

2.6 豆漿灌根對大田土壤細菌（門水平）群落結構的影響

豆漿灌根不同時間點土壤細菌門水平的相對豐度見圖3。樣品中含量大于1%的細菌類群共有13 個，分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌 門 （Gemmatimonadetes） 、浮 霉 菌 門（Planctomycetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、藍細菌（Cyanobacteria）、棲熱菌 門（Deinococcus-Thermus）、疣 微 菌 門（Verrucomicrobia）、裝甲菌門（Armatimonadetes）。

表6 豆漿灌根對土壤細菌OTUs 的影響Tab.6 Effects of root irrigation with soymilk on soil bacteria OTUs

豆漿灌根初期（5 d），不同處理間土壤優勢菌門豐度差異明顯。豆漿灌根初期，土壤變形菌門和擬桿菌門相對豐度上升明顯，放線菌門、酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門和硝化螺旋菌門所占比例下降顯著，表明豆漿灌根短期內可明顯改變土壤的細菌群落結構；傳統豆漿和酵解豆粕處理對土壤細菌群落的影響也有差異，與對照相比，傳統豆漿施用后放線菌門所占比例顯著下降，酵解豆粕施用后的芽單胞菌門和裝甲菌門所占比例下降明顯，而厚壁菌門所占比例有所上升，這可能是由于傳統豆漿與酵解豆粕自身性質不同造成的。豆漿灌根后中后期（35 d 和95 d），不同處理間主要的13 種細菌門類的相對豐度無顯著差異。

圖2 豆漿灌根后5 d（A、D）、35 d（B、E）和95 d（C、F）土壤細菌Chao 和Shannon 指數比較Fig.2 Comparison of Chao and Shannon indices of soil bacteria on the 5th(A,D),35th(B,E)and 95th(C,F)days after root irrigation with soymilk

圖3 豆漿灌根后5 d（A）、35 d（B）和95 d（C）土壤細菌門水平群落分布相對豐度比較Fig.3 Abundances of bacterial communities at phylum level in tobacco-planting soil on the 5th(A),35th(B)and 95th(C)days after root irrigation with soymilk

2.7 豆漿灌根對大田土壤功能性細菌屬相對豐度的影響

由表7 看出，土壤中不同細菌屬在豆漿灌根前后表現差異較大，如鏈霉菌屬和克雷白氏桿菌屬在酵解豆粕處理后的豐度分別為6.23%和3.53%，顯著高于傳統豆漿處理（1.59%和0.04%）和對照（2.78%和0.01%）；鞘脂單胞菌屬在傳統豆漿處理后的豐度（1.39%）顯著高于酵解豆粕處理（0.33%）和對照（0.20%）；產黃桿菌屬、Massilia、噬幾丁質菌屬、鞘氨醇桿菌屬等在豆漿灌根后的豐度均顯著增加；除硝化細菌屬和芽單胞菌屬外，其他參與養分循環的細菌屬豐度均低于傳統豆漿或酵解豆粕處理。芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、Pseudoduganella 和藤黃色桿菌屬等4 種細菌為植物 根 際 促 生 菌（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR 菌），其主要功能是分泌植物生長調節劑而促進植物生長。與對照相比，4 種細菌屬在對照中的豐度均顯著低于傳統豆漿和酵解豆粕處理。豆漿灌根后，溶桿菌屬、假黃單胞菌屬、分枝桿菌屬和蛭弧菌屬等拮抗微生物的豐度均高于對照，可通過溶菌作用或產生抗生素類物質等方式對土傳病原菌產生拮抗作用。豆漿灌根處理后致病菌Aquicella 的相對豐度下降50%。

表7 豆漿灌根初期土壤中功能細菌的豐度變化Tab.7 Changes in abundances of soil bacteria at early stage of root irrigation with soymilk （%）

3 討論

3.1 豆漿灌根條件下植煙土壤細菌數量和群落結構的變化

細菌是土壤中的主要微生物類群，在土壤的物質循環轉化中發揮著重要作用。土壤細菌的數量、多樣性和群落結構與植物生長及病害防治密切相關［11-12］。研究發現，施用芝麻餅肥可明顯改善烤煙根際微生物區系，顯著提高各類微生物數量［13］。秸稈還田和腐熟有機肥對提高土壤微生物數量有明顯作用，對植煙土壤細菌群落多樣性無顯著影響［14］，與本試驗中豆漿灌根后土壤細菌數量大幅度提高，灌根中后期細菌多樣性指數與對照相比無顯著差異的研究結果一致。這可能是由于傳統豆漿和酵解豆粕施入土壤后，增加了土壤活性有機碳和土壤蛋白含量，為細菌快速繁殖提供了新的能源和營養源，而未改變土壤細菌的多樣性指數。本研究中各處理土壤的優勢菌群均為變形菌門、放線菌門、擬桿菌門等13 個優勢菌群，但其所占比例有較大差異，這與前人的研究結果一致［15］。變形菌門被認為是土壤中最常見的菌門［16］，與土壤中碳的利用有關［17］；酸桿菌在土壤中分布廣泛，多存活于貧瘠的土壤環境中［18-19］，其豐富度與碳可用性呈負相關［17］。因此，變形菌門和酸桿菌門可用作土壤養分狀況的指示菌［20］。放線菌是產生抗生素的主要細菌，土壤中放線菌數量及拮抗放線菌的比例，對調整土壤微生物生態平衡有至關重要作用［21］。本研究中豆漿灌根后，土壤中變形菌門相對豐度提高明顯，酸桿菌門所占比例下降顯著，表明豆漿灌根處理可能提高了土壤碳源的可利用性，這也與檢測到的土壤活性有機碳含量增加的試驗結果一致；其次，傳統豆漿灌根后放線菌門所占比例顯著下降，可能是因為傳統豆漿中存在有抑制放線菌門的抗菌物質所致。

土壤微生物可對土壤的微小變化作出敏感反應，其群落結構在很大程度上決定了土壤的生物活性，因此被認為是土壤生態系統變化的預警指標［22-23］。土壤特異微生物主要包括生理類群微生物、拮抗微生物、病原微生物等［24］；對植物的積極作用主要有參與養分循環、抑制病原菌以及分泌植物生長調節劑等，消極作用主要是產生病害［25-26］。微生物生理類群在土壤生態中發揮重要作用，如硝化螺菌屬、固氮菌、鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬等在物質轉化中具有特定的功能，其分布特征和數量通常與土壤碳氮循環密切相關，直接影響土壤肥力［27］。本試驗中豆漿灌根初期，除硝化螺菌屬和芽單胞菌屬在對照中的豐度高于傳統豆漿和酵解豆粕處理外，多種細菌如鏈霉菌屬、產黃桿菌屬、水恒桿菌屬、克雷白氏桿菌、鞘脂單胞菌屬、鏈霉菌屬、Massilia、鞘氨醇桿菌屬、噬胞菌屬、纖維弧菌屬等在土壤中的相對豐度均有顯著提高，這些功能細菌在根際周圍發揮了固氮、解磷、解鉀、礦化復雜有機物、降解有機物以及分泌生長激素促進根系生長的作用，說明豆漿灌根能促進植煙土壤中有益生理類群微生物的繁殖，進而影響土壤肥力［28-29］。

植物根際促生菌對土壤有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物都有生防作用，可促進植物對礦質營養的吸收和利用，并可產生有益于植物生長的代謝產物（如生長素），進而促進植物的生長發育［30］。有報道認為，芽孢桿菌屬和假單胞菌屬是土壤中分布較多的根際促生菌之一［31］，Pseudoduganella 是健康土壤中的標志細菌之一［32］，藤黃色桿菌屬能促進植物根系生長［33］。本研究中發現，傳統豆漿及酵解豆粕施用后，芽孢桿菌、假單胞菌屬豐度顯著提高，說明豆漿灌根有利于煙株根系吸收礦質營養。

溶桿菌屬、假黃單胞菌屬、分枝桿菌和蛭弧菌屬等作為生防細菌，具有溶菌作用，可拮抗多種植物病害［34］，Aquicella 是連作土壤中的土傳病原菌之一［20］。豆漿灌根后4 種生防細菌屬的豐度均高于對照，而致病菌Aquicella 豐度低于對照，說明豆漿灌根能提高根際土壤拮抗微生物的豐度，降低致病菌含量，有利于土壤根際周圍形成健康微生物群落結構，促進烤煙根系生長發育。

3.2 豆漿灌根條件下植煙土壤養分和烤煙生長的變化

大田土壤中的氮素及中微量微量元素可通過施肥補充，一旦補充量不足或補充時間錯位，土壤養分易出現虧損，致使農作物生長不良，嚴重時甚至造成大幅減產［35］。傳統豆漿和酵解豆粕中有機質含量高，且含有一定量的氮、磷、鉀及中微量元素。在烤煙由團棵期轉至旺長期的關鍵階段，豆漿灌根在補充土壤水分的同時，可作為土壤養分元素的重要補充途徑。有研究表明，秸稈還田和腐熟有機肥可提高植煙土壤的速效鉀、有機碳、有效鎂等養分含量［14］；復方有機菌肥可顯著提高土壤堿解氮含量，與化肥和芝麻餅肥配施可明顯提高土壤肥力水平［36］。生物有機肥不僅能顯著提高土壤有機碳、速效磷和速效鉀含量，同時可提高土壤微生物的功能多樣性［37］?；旌嫌袡C肥、汽爆玉米秸稈和草炭等有機物料可明顯提高土壤活性有機碳含量和碳庫活度，改善煙株根際土壤環境［38-39］。本試驗中傳統豆漿和酵解豆粕處理后，土壤活性有機碳和土壤蛋白在豆漿灌根初期上升明顯?；钚杂袡C碳和土壤蛋白作為土壤中微生物的主要碳源和氮源，可促進煙株根系周圍形成更加健康的土壤微生態環境，促進煙草根系生長發育，這可能是豆漿灌根促進烤煙根系生長的主要原因之一。總體來看，豆漿灌根初期參與土壤養分循環、抑制病原菌、分泌植物生長調節劑及抑制病原菌等功能細菌的豐度顯著提高，伴隨土壤活性有機碳和土壤蛋白含量顯著升高，煙株根系生長健壯；豆漿灌根中后期土壤速效氮、有效磷、速效鉀等養分含量保持較高水平，并一直持續到烤煙成熟期，這可能是煙株中上部葉片長寬增加的主要原因。

4 結論

豆漿灌根初期土壤蛋白和活性有機碳含量顯著提高，中后期土壤堿解氮、有效磷和速效鉀等養分保持較高含量水平。豆漿灌根可促進烤煙根系和地上部煙葉生長，豆漿灌根初期土壤中多個優勢菌門豐度差異明顯，參與養分循環、分泌植物生長調節劑、抑制病原菌等功能細菌豐度明顯升高。因此，豆漿灌根可提高土壤養分含量，提升功能細菌的相對豐度，改善土壤微生態環境，促進烤煙根系和葉片生長發育。