核桃仁乙醇提取物通過調節BDNF/TrkB信號通路改善阿爾茲海默病大鼠學習記憶功能

潘建萍，鐘禹霖，鄧 華

(贛南衛生健康職業學院，江西 贛州 341000)

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是臨床上常見的中樞神經系統退行性疾病，且隨著社會老齡化問題加劇和人口壽命的延長，AD發病率有逐年升高之趨勢，嚴重影響老人的身心健康和生活質量[1-2]。學習記憶能力下降、認知功能障礙等是AD發病的主要臨床特征。目前AD發病確切機制尚不明確，臨床仍無特效治療藥物。核桃自古作為健腦食品，《本草綱目》中記載核桃可令人肥健、添腦髓。雖有不少研究結果[3-5]表明核桃通過調節膽堿酯酶和抗氧化作用改善AD大鼠的空間學習記憶能力，但是關于核桃發揮抗AD的確切分子機制仍需深入。本研究采用大鼠側腦室注射Aβ1-40復制AD模型，探討核桃仁乙醇提取物對模型大鼠的空間學習記憶的改善作用及其分子生物學作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物及分組

選取SD大鼠隨機分為模型對照組和A、B、C(低、中、高劑量)治療組。A組核桃仁提取生藥0.05 g/100 g灌胃，B組核桃仁提取生藥0.15 g/100 g灌胃，C組核桃仁提取生藥0.5 g/100 g灌胃，以口服蒸餾水作為對照。

1.2 主要試劑及儀器

BACE1和ADAM10檢測試劑盒購自Thermo Fisher公司；兔抗鼠BDNF抗體、兔抗鼠p-TrkB、兔抗鼠p-CREB和羊抗兔IgG-HRP二抗均購自Abcam公司。

1.3 大鼠學習記憶能力檢測

采用Morris檢測大鼠學習記憶能力，首先對大鼠進行適應性練習，大鼠每天在固定時間點進入水中練習，1次/d，60 s/次。連續練習6 d。實驗中研究人員記錄大鼠進入水池運動動態及逃避潛伏期、平臺穿越次數。

1.4 大鼠海馬組織中BACE1、ADAM10活性檢測

大鼠Morris水迷宮實驗結束后，處死大鼠并解剖分離海馬組織，將含有蛋白酶抑制劑T-PER試劑與海馬組織混合制備勻漿，以溫度4 ℃、離心速度16 000 r/min離心60 min，收集上層清液并測定總蛋白濃度，按ELISA試劑盒操作步驟進行ADAM10、BACE1酶活性測定。

1.5 大鼠海馬組織中BDNF、P-TrkB蛋白和TrkB蛋白表達水平檢測

采用Western blot法檢測。取新鮮冰凍的海馬按比例加入裂解液進行勻漿，勻漿后充分裂解30 min，12 500 r/min離心10 min后取上清。取出100 μL上清液加上樣緩沖液，100 ℃煮沸10 min使蛋白變性，以BCA法進行蛋白定量，以 10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉移法轉移至PVDF膜，室溫下用封閉液封閉2 h后，加入兔抗鼠BDNF抗體(1∶500 Abcam，英國)、兔抗鼠p-TrkB(1∶200 Abcam，英國)和兔抗鼠p-CREB抗體(1∶200 Abcam，英國)4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育2 h，TBS緩沖液沖洗3次，加入羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育1 h，TBS緩沖液沖洗后，化學發光法顯色。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮行為學檢測結果比較

A、B、C組大鼠逃避潛伏期明顯短于對照組，平臺穿越次數明顯多于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

組別大鼠數(n)逃避潛伏期(s)平臺穿越次數(次)A組636.75±7.54?1.97±0.52?B組628.92±6.86??2.88±0.78?C組625.63±6.24??3.25±0.94??對照組642.18±7.651.56±0.36

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 各組大鼠海馬組織中ADAM10、BACE1酶活性比較

A、B、C三組與對照組比較，核桃仁乙醇提取物上調海馬組織中ADAM10表達，下調BACE1表達，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

組別大鼠數(n)ADAM10BACE1A組6167.52+21.56448.12+45.75?B組6208.38+24.68?405.73+43.54?C組6234.21+26.34??368.38+38.96??對照組6140.96+16.56512.45+64.82

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 各組大鼠海馬組織中BDNF/TrkB通路相關蛋白表達比較

A、B、C三組與對照組比較，BNDF、P-TrkB、p-CREB蛋白質表達水平明顯上升，C組變化更突出，差異具有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkB通路相關蛋白表達比較

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究采用低、中、高三個劑量在對AD大鼠干預1個月后采用Morris水迷宮判斷其行為功能水平及用分子生物學方法研究其作用機制。研究結果顯示，經用核桃仁乙醇提取物干預后，逃避潛伏期縮短，平臺穿越次數增多，學習記憶能力較模型對照組改善，且呈劑量濃度依賴性，差異具有統計學意義，提示核桃仁乙醇提取物具有改善AD大鼠的學習記憶功能。

阿爾茨海默病發病機制較為復雜，但主要是Aβ在海馬等重要腦區部位沉積并形成老年斑，從而神經功能受到損傷，導致認知功能障礙[6-7]。近年來，隨著對β淀粉蛋白前體蛋白(APP)處理途徑認識的不斷深入，APP降解的關鍵酶在AD發病中的作用越來越被重視。α分泌酶(ADAM10)和BACE1是降解APP作用截然不同的兩個重要關鍵酶，同時也是治療AD的重要藥物靶點。有研究發現，ADAM10有切割APP功能的α分泌酶活性，將AD小鼠與ADAM10轉基因小鼠雜交或將大鼠過表達 ADAM10基因發現淀粉樣斑塊明顯減少，可溶性產物APPs-α增多，學習和記憶功能障礙明顯改善[8-10]。而AD模型鼠和患者腦中BACE1的蛋白表達水平顯著高于同齡野生鼠[11-12]和非AD患者；反之，通過SiRNA沉默或基因敲除等手段抑制BACE1酶活性可使APP裂解產生Aβ減少，淀粉樣斑塊減輕[13-14]。為探究核桃仁乙醇提取物改善大鼠學習記憶功能是否與APP降解酶相關，研究中檢測了ADAM10和BACE1酶活性。本研究結果表明，核桃仁乙醇提取物提高AD模型大鼠的學習記憶能力，其作用機制與上調海馬組織中ADAM10表達水平和下調BACE1表達有關。

核桃仁乙醇提取物通過調控APP降解的兩個重要關鍵酶，從而改善AD大鼠的學習記憶障礙。為探究其更深層次的分子生物學機制，研究中進一步檢測了BDNF/TrkB信號通路。BDNF/TrkB通路在神經再生及突觸功能重塑中發揮著重要作用，能夠改善AD認知障礙。Arancibia S等[15]、Kimura N等[16]發現激活BDNF/TrkB通路能抑制Aβ對神經元的毒性反應，并且該過程能被TrkB受體特異性抑制劑阻斷；阻斷海馬神經元的BDNF/TrkB信號通路使胞內外Aβ沉積增加并且激活其毒性，導致神經元死亡。Li N等[17]研究表明，Aβ的沉積導致APP/PS1小鼠海馬部位BDNF/TrkB/CREB信號通路功能障礙。本研究結果顯示，A、B、C三組中BNDF、p-CREB、p--TrkB蛋白質表達水平明顯上升，C組變化最突出，差異具有統計學意義(P<0.05)，提示BDNF/TrkB/CREB信號通路可能參與核桃仁乙醇提取物改善AD大鼠學習記憶功能的調節。

綜述所述，核桃仁乙醇提取物通過調節APP降解的兩個重要關鍵酶，改善AD大鼠空間學習記憶能力，這種作用可能是通過調節BDNF/TrkB/CREB信號通路實現。