不同炮制程度黃柏炭對(duì)小鼠的止血作用研究

羅 婷，王佳琪，范順明，張春玲，余凌英*，譚 睿

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611137；2.西南交通大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610031)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(shù)PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹(shù)皮。習(xí)稱“川黃柏”。剝?nèi)?shù)皮后，除去粗皮，曬干。黃柏具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效[1]。黃柏炭作為黃柏的炮制品，黃柏的炭制初載于宋代《小兒衛(wèi)生總微論方》曰：“燒存性”[2]。《得配本草》[3]中記載：“川黃柏治上酒制，治中蜜炙，治下鹽水制。止崩帶炒炭，涂瘡乳調(diào)。”元代葛可久在《十藥神書(shū)》中提出“大抵血熱則行，血冷則凝，見(jiàn)黑則止，此定理也。”[4]黃柏制炭后，苦寒之性大減，收澀之性增加，清濕熱之中兼具澀性，可用于治療便血、崩漏下血[5]。現(xiàn)代文獻(xiàn)中，對(duì)于黃柏炭止血作用的研究較少，2015年版《中國(guó)藥典》中描述黃柏炭的性狀為表面焦黑色，內(nèi)部深褐色或棕黑色，但由于炮制程度的不同，黃柏炭止血作用可能不同。因此，本實(shí)驗(yàn)將同一批次黃柏制炭成不同炮制程度的黃柏炭樣品，采用剪尾法、玻璃毛細(xì)管法來(lái)研究其止血作用。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠，雄性，體質(zhì)量20～22 g，清潔級(jí)，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030。

飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)小鼠的飼養(yǎng)條件：溫度：(24±1)℃，相對(duì)濕度：55%～65%，每天喂食、加水1次，可自由進(jìn)食。

1.2 藥物

黃柏購(gòu)買于四川省中藥飲片有限責(zé)任公司(批號(hào)：171124)；云南白藥膠囊(云南白藥集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：Z53020799)。

1.3 試劑與儀器

MS-5炒藥機(jī)(邁斯機(jī)械有限公司)；XW-80A渦旋混合器(上海馳唐電子有限公司)；YP30002電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)；KQ-300E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；玻璃毛細(xì)采血管(內(nèi)徑1 mm，長(zhǎng)100 mm)；其余小鼠灌胃器、手術(shù)剪、電子計(jì)時(shí)鐘、濾紙、注射用針頭等為常規(guī)實(shí)驗(yàn)室用品。

2 實(shí)驗(yàn)用藥配置

2.1 黃柏炭的炮制

參照文獻(xiàn)方法[6]炮制不同程度的黃柏炭樣品。稱取300 g黃柏生品，當(dāng)炒藥機(jī)溫度達(dá)到270 ℃時(shí)進(jìn)行炒制，炒制時(shí)間12～13 min時(shí)炮制成黃柏炭①；炒制溫度270 ℃，炒制時(shí)間14～15 min時(shí)炮制成黃柏炭②；炒制溫度270 ℃，炒制時(shí)間16～17 min時(shí)炮制成黃柏炭③；炒制溫度270 ℃，炒制時(shí)間18～19 min時(shí)炮制成黃柏炭④。各個(gè)炮制品性狀描述見(jiàn)表1。

表1 不同炮制程度黃柏炭的性狀

2.2 陽(yáng)性對(duì)照藥配置

稱取云南白藥膠囊內(nèi)粉末適量，加0.5%CMC-Na溶液研磨，定容，制成濃度為26 mg·mL-1的云南白藥混懸液，用時(shí)超聲處理混勻。

2.3 樣品藥液配置

分別取各飲片100 g，加10倍的水浸泡0.5 h，煮沸1 h后過(guò)濾，再加8倍量的水煮沸0.5 h，合并兩次濾液，將濾液減壓濃縮為1.56 g·mL-1的黃柏炭水煎液。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組與給藥

70只昆明種小鼠，雄性，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、黃柏生品組、黃柏炭①組、黃柏炭②組、黃柏炭③組、黃柏炭④組7組，每組10只小鼠。空白對(duì)照組給予生理鹽水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予0.26 g·kg-1云南白藥灌胃，其余組給予3.12 g·kg-1樣品水煎液灌胃。每天灌胃1次，灌胃7天。

3.2 小鼠凝血時(shí)間的測(cè)定[7-9]

在第7天給藥40 min后，將內(nèi)徑1 mm的玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼球靜脈叢采血，灌注血液后置于桌面上水平放置，每隔20 s折斷毛細(xì)管0.5 mm，并緩慢向左右拉開(kāi)，觀察折斷面有無(wú)血凝絲出現(xiàn)，至血凝絲出現(xiàn)為止，所歷時(shí)間即為小鼠凝血時(shí)間。

3.3 小鼠出血時(shí)間測(cè)定[7-9]

同時(shí)用解剖剪將小鼠尾尖2 mm處剪斷，待血自行溢出時(shí)，每30 s用濾紙吸血1次至血液自然停止為止，測(cè)定時(shí)間。

3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析，組間比較ANOVA，LSD分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組小鼠凝血時(shí)間對(duì)比

與空白組對(duì)比，黃柏生品組凝血時(shí)間有所減少，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4種不同炒炭程度黃柏炭的凝血時(shí)間明顯減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且與陽(yáng)性藥凝血時(shí)間接近。黃柏炭③凝血時(shí)間最少，效果最明顯。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠凝血時(shí)間對(duì)比

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4.2 各組小鼠出血時(shí)間對(duì)比

與空白組對(duì)比，黃柏生品與黃柏炭①出血時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，黃柏炭③與黃柏炭④出血時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，黃柏炭②出血時(shí)間最短，呈顯著性(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠出血時(shí)間對(duì)比

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

5 討論

本次實(shí)驗(yàn)方法選擇了“眼球后靜脈叢取血法”(眼眶取血實(shí)驗(yàn))和“斷尾實(shí)驗(yàn)”分別對(duì)7組小鼠的凝血時(shí)間和出血時(shí)間進(jìn)行記錄，并采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，再通過(guò)LSD來(lái)多組對(duì)比分析。參考多方面的數(shù)據(jù)綜合分析，從而對(duì)黃柏炭對(duì)于小鼠止血作用做出科學(xué)評(píng)價(jià)。

止血藥在中藥之中很多，炭藥在其中屬于上品，因?yàn)槌刺亢蟮闹兴幨諠γ黠@增加，促進(jìn)其凝血止血作用，早在古代就形成了炭藥的獨(dú)特理論——炒炭止血。自元代葛可久提出了“血見(jiàn)黑則止”的炭藥止血理論，炭藥品種大量增加，并多用于出血類疾病，自此，炭藥的應(yīng)用逐步集中在止血方面[10-12]。黃柏，生能清熱燥濕，炒炭后具有止血效果。本次小鼠止血實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：不同炮制程度的黃柏炭水提液能顯著縮短小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，具有良好的止血作用。黃柏炭③凝血時(shí)間最優(yōu)，黃柏炭②出血時(shí)間最少，兩種程度黃柏炭均符合2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)于黃柏炭性狀的要求。而黃柏炭①與④在兩次止血實(shí)驗(yàn)中藥效學(xué)不及黃柏炭②和③，可能是因?yàn)辄S柏炭①炒炭未達(dá)到炭藥性狀要求，黃柏炭④則完全炭化，炒炭太過(guò)。為了能更正確地運(yùn)用炮制技術(shù)、規(guī)范飲片質(zhì)量，需多學(xué)科多角度研究中藥炭藥止血的作用機(jī)制，對(duì)炭藥止血理論不斷加以充實(shí)、完善，以利于中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化，推動(dòng)中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展。