海貍鼠源性成分的PCR鑒別研究

段慶梓，張玉，王巍，尚柯，梁恒興

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，四川成都610045）

基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)的目標(biāo)基因檢測(cè)已成為動(dòng)物源性鑒別的主要方法[1-2]，目前常見的動(dòng)物源性成分檢測(cè)已形成了獨(dú)立的PCR方法標(biāo)準(zhǔn)[3-4]，并廣泛應(yīng)用于動(dòng)物成分的檢測(cè)中。近年來，海貍鼠（Myocastor coypus）養(yǎng)殖在我國(guó)各地逐漸興起，主要由于其附加產(chǎn)品具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。海貍鼠的毛皮可作為皮草的原材料，脂肪組織可以用于化妝品原料，尾筋可用于制作手術(shù)縫合線[5]。但其肉質(zhì)并未有明確的用途，對(duì)其肉質(zhì)的后期處理也沒有可溯源的檢測(cè)方法。

為了避免海貍鼠肉違規(guī)流入市場(chǎng)，本研究擬建立海貍鼠成分的PCR檢測(cè)方法，用于檢測(cè)肉及肉制品中是否摻雜有海貍鼠成分。本方法主要通過海貍鼠與其他常見物種的細(xì)胞色素b（cyto chromed，Cytb）基因比對(duì)，尋找堿基差異序列設(shè)計(jì)海貍鼠特異性引物，并通過優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)，建立海貍鼠源性檢測(cè)的PCR方法，為海貍鼠源性成分的鑒別提供了分子檢測(cè)依據(jù)。

1 材料

1.1 樣品

海貍鼠、竹鼠：河南安陽(yáng)海貍鼠養(yǎng)殖場(chǎng)；大鼠、小鼠、豚鼠：成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院藥理室；其他常見肉樣（豬、牛、羊、雞、鴨、兔）：市購(gòu)。

1.2 試劑

細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒：上海捷瑞生物工程有限公司；2×PCR預(yù)混液：TAKARA公司；DNA分子量標(biāo)記：天根生化科技（北京）有限公司；海貍鼠特異性引物：由生工生物工程（上海）有限公司合成；無水乙醇：分析純，廣東光華科技股份有限公司；水為滅菌的去離子水。

1.3 儀器與設(shè)備

BSA223S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；5427R低溫離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；DK-420電熱恒溫水槽：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；P330核酸蛋白儀：德國(guó)IMPLEN公司；Veriti 96-well PCR儀：Thermo Fisher Scientific公司；Power Pac Basic電泳儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Gel Doc310凝膠成像儀：美國(guó)UVP公司。

2 方法

2.1 海貍鼠引物設(shè)計(jì)

線粒體基因由于具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速率快、多態(tài)性豐富、無重組和遵循母系遺傳等特點(diǎn)，是一個(gè)比較理想的用于檢測(cè)的靶基因，且在動(dòng)物的組織細(xì)胞中均含有大量線粒體[6-7]，因此本研究選取線粒體的細(xì)胞色素b（Cytb）基因作為目標(biāo)檢測(cè)的靶基因。在 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中查找海貍鼠（AF422919.1、EU544663.1、LC257678.1、LC257679.1）、竹鼠（NC_039-104.1）、大鼠（EU349782.1）、小鼠（LC325158.1）、豚鼠（HM447187.1）及豬（AB015079.1）、牛（MH714782.1）、山羊（KY662383.1）、綿羊（KY662385.1）、雞（AF028-795.1）、鴨（EU009397.1）和兔（U07566.1）的 Cytb基因序列，并使用MegAlign軟件進(jìn)行物種間的序列比對(duì)，在海貍鼠與其他物種的DNA堿基差異區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物。

2.2 樣品前處理及DNA提取

分別取不同物種樣品的肌肉組織100 mg置于2 mL離心管中，依據(jù)細(xì)胞/組織基因組提取試劑盒操作說明進(jìn)行DNA提取，并測(cè)定DNA的濃度和純度。將得到的各物種DNA濃度稀釋至20 μmol/L用于PCR反應(yīng)。

2.3 PCR方法的建立

通過對(duì)特異性引物的不同退火溫度（52、54、56、58 ℃）和 PCR反應(yīng)不同循環(huán)數(shù)（20、25、30、35）的考察，來確定PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度為2%），電泳條件為6 V/cm，電泳時(shí)間為30 min。電泳完畢后，將瓊脂糖凝膠置于成像儀下照相并保存照片。

2.5 檢出限的確定

為確定海貍鼠源性鑒別PCR反應(yīng)的檢出限，設(shè)計(jì)檢出限樣品的制備：分別以雞肉、兔肉為基質(zhì)，制備不同海貍鼠肉質(zhì)量比（50%、10%、1%、0.1%、0.01%）的混合肉樣。以50%質(zhì)量比的混合肉樣為例，取200 mg海貍鼠肉（質(zhì)量比為100%）加入到200 mg雞肉或兔肉中，充分均質(zhì)混勻，即得。10%、1%，0.1%和0.01%的混合肉樣同法制備。分別取100 mg的不同質(zhì)量比混合肉樣進(jìn)行DNA提取和海貍鼠源性成分的PCR擴(kuò)增。

2.6 方法的特異性考察

以海貍鼠為陽(yáng)性對(duì)照，選取常見的鼠類（竹鼠、大鼠、小鼠、豚鼠）和物種（豬、牛、羊、雞、鴨、兔）作為陰性對(duì)照，用滅菌的去離子水作為空白對(duì)照，進(jìn)行PCR反應(yīng)，來考察海貍鼠源性PCR反應(yīng)的特異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 海貍鼠特異性引物序列

海貍鼠與其他物種的Cytb基因序列比對(duì)結(jié)果見圖1。

由圖1，確定海貍鼠特異性引物為，上游引物F：5'-TGTAT GCTTA GCCCT ACAAA TCAC-3'，下游引物R：5'-GCATT AGTAT GAATA ATAGT-3'。該引物對(duì)擴(kuò)增的海貍鼠片段長(zhǎng)度約為599 bp。

3.2 特異性引物退火溫度的確定

根據(jù)特異性引物堿基序列估算引物的退火溫度，分別設(shè)置退火溫度為52℃～58℃進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖2所示。

52℃～58℃均有海貍鼠源性的PCR擴(kuò)增，當(dāng)退火溫度為58℃時(shí)，PCR產(chǎn)物豐度與其他溫度相比較弱，而52℃～56℃的擴(kuò)增條帶亮度較為一致，依據(jù)退火溫度越高，引物結(jié)合的特異性越好的原則，選擇56℃為特異性引物的最佳退火溫度。

3.3 PCR循環(huán)數(shù)的確定

設(shè)定PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)分別為20、25、30和35個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)果如圖3所示。

圖1 海貍鼠與其他物種的Cytb基因序列比對(duì)Fig.1 Sequenc ealignmnet of Cytb between Myocastor coypus and other species

圖2 不同退火溫度考察Fig.2 Investigation of different annealing temperatures

由圖3可知，在設(shè)定的20～35個(gè)循環(huán)之間都有擴(kuò)增條帶，且隨著循環(huán)數(shù)的增加呈逐步變亮的趨勢(shì)，但30個(gè)循環(huán)和35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增亮度基本一致，無明顯差異，因此，為節(jié)約反應(yīng)時(shí)間設(shè)定該P(yáng)CR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)為30個(gè)循環(huán)。

3.4 PCR反應(yīng)體系的確定

圖3 不同反應(yīng)循環(huán)數(shù)考察Fig.3 Investigation of different reaction cycles

依據(jù)特異性引物的退火溫度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)，PCR反應(yīng)的總體積為25 μL：包括2×PCR混合液12.5 μL、正、反向引物（10 μmol/L）各 0.4 μL、模板 DNA 2 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s），72℃5 min。

3.5 PCR檢出限的確定

對(duì)海貍鼠肉質(zhì)量比為100%、10%、1%、0.1%和0.01%的混合肉樣分別進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 海貍鼠PCR反應(yīng)檢出限結(jié)果Fig.4 PCR result of Myocastor coypus detection limit reaction

由圖4可知，在雞肉和兔肉中添加0.1%的海貍鼠肉時(shí)即被檢出，PCR條帶較弱，但隨著海貍鼠肉比例的增加，PCR條帶的亮度也逐漸變亮，與添加量的變化呈正相關(guān)。該結(jié)果表明，所建立的海貍鼠PCR反應(yīng)所能檢出海貍鼠源性的檢出限為0.1%，反應(yīng)體系的靈敏度較高。

3.6 PCR反應(yīng)的特異性驗(yàn)證

分別取其他常見鼠類（竹鼠、大鼠、小鼠、豚鼠）和常見物種（豬、牛、羊、雞、鴨）進(jìn)行PCR反應(yīng)的特異性試驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示。

圖5 海貍鼠PCR反應(yīng)特異性結(jié)果Fig.5 PCR result of Myocastor coypus specificity reaction

由圖5可知，PCR反應(yīng)僅對(duì)海貍鼠樣品有目的條帶的擴(kuò)增，對(duì)其他常見鼠類和動(dòng)物源性無擴(kuò)增條帶。該結(jié)果表明所建立的海貍鼠PCR反應(yīng)特異性較好，符合PCR反應(yīng)的預(yù)期要求。

4 結(jié)論

本研究依據(jù)常用動(dòng)物源性成分特異性PCR方法的設(shè)計(jì)原理[8-10]，將海貍鼠與其他常見物種Cytb基因進(jìn)行序列比對(duì)，在堿基差異區(qū)域設(shè)計(jì)了特異性引物，并用過參數(shù)優(yōu)化和相關(guān)考察建立了海貍鼠源性檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系，該方法能夠?qū)Ｘ偸髷U(kuò)增大小為599 bp的條帶，而對(duì)其他物種無擴(kuò)增，因此得以鑒別。通過進(jìn)行海貍鼠與雞肉、兔肉不同比例混合肉樣的方法研究，該體系對(duì)海貍鼠源性的檢測(cè)低限可達(dá)到0.1%。同時(shí)，建立的海貍鼠特異性PCR鑒別體系對(duì)其他常見物種有較好的方法特異性。

綜上所述，本研究建立的海貍鼠源性成分的PCR檢測(cè)方法，能夠完成對(duì)海貍鼠源性成分的專屬性檢測(cè)，且方法準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，能夠滿足海貍鼠源性成分檢測(cè)的市場(chǎng)需求，為檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)或企業(yè)提供一定的技術(shù)支撐。