乙醇預處理水酶法提取牡丹籽油的工藝優化

王慧娟，吳正奇，黃夢萍，葉文祥，萬端極，*

（1.湖北工業大學土木建筑與環境學院，湖北武漢430068；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北武漢430068）

牡丹屬芍藥科落葉灌木，也是中國著名的觀賞華卉[1]。牡丹籽含油率在24%～37.8%左右[2]，其中不飽和脂肪酸含量超過90%，亞麻酸約占到45%[3-4]，而不飽和脂肪酸可降低冠心病風險[5]。牡丹籽油相較亞麻籽油，γ-生育酚、角鯊烯、甾醇含量更高[6]，而它們均具有良好的抗氧化作用。研究表明，牡丹籽油具有良好的抗氧化[7]、降血脂[8]、抗糖尿病[9]、防曬作用[10]，無毒食用安全[11]，高溫煎炸10次仍符合國家植物油衛生標準[12]。據不完全統計，我國油用牡丹種植面積約有2萬hm2，牡丹籽油加工企業9個[13]，其中，菏澤堯舜牡丹生物科技有限公司采用超臨界CO2萃取技術，已建成國內最大的牡丹籽油生產線[14]。

目前，工業中提取植物油的方法主要為壓榨法和溶劑法。水酶法作為新興的提油方法，因其提油率高、提取條件溫和、沒有引入其他溶劑、提油的同時可以得到水解蛋白，近年來受到頗多關注。現階段牡丹籽油的水酶法工藝存在的主要困難是形成較厚的乳化層，限制了油脂的游離。Rosenthal等[15]指出乳化層的破乳取油為水酶法的一大技術難點。本試驗采用乙醇預處理水酶法提取牡丹籽油，利用乙醇的破乳作用，研究乙醇預處理階段中料液比、乙醇濃度、反應溫度、反應時間對游離油提取率的影響，從而確定了乙醇預處理的最佳提油工藝條件，以期為牡丹籽油的工業化應用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡丹籽仁：產自山西；堿性蛋白酶（20萬U/g）：龐博生物工程有限公司；其它試劑均為分析純。

HH-601電熱恒溫水浴鍋：上海偉業儀器廠；320-S pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；101A-1型電熱鼓風干燥箱：南京恒星實驗設備有限公司；EX223ZH電子精密天平：奧豪斯國際貿易（上海）有限公司；DK-98-Ⅱ電子萬用爐、SX-10-12型箱式電阻爐控制箱、FW177中草藥粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；K1100F全自動凱式定氮儀、SH420F石墨消解儀：武漢海能科學儀器有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取方法及操作要點

牡丹籽仁→篩選→干燥→粉碎→過篩（40目）→乙醇預處理→離心→渣相→加水堿提→酶解→離心→牡丹籽游離油

選用新鮮牡丹籽仁，剔除未完全去殼部分，余下部分在65℃的烘箱中干燥至恒重，然后用中草藥粉碎機粉碎（注意防止粉碎機溫度過高造成油脂氧化）后過40目篩，準確稱取牡丹籽粉與一定濃度的乙醇溶液按一定的料液比混合，在一定的溫度下反應一定時間后離心（3 000 r/min），得上清液和渣相；上清液即乙醇提取液，渣相按1∶3（g/mL）的料液比加水混勻，在pH 10.0、溫度為35℃下堿提1 h，然后將混合液的溫度和pH值調節為堿性蛋白酶最適條件，加入15%的酶量（酶/底物·干基計）酶解5 h后離心（3 000 r/min），取上層清油即為牡丹籽游離油，測定游離油提取率。

1.2.2 單因素試驗

按照1.2.1的工藝，研究乙醇溶液料液比、乙醇濃度、反應溫度、反應時間對游離油提取率的影響。

1.2.2.1 料液比對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與70%的乙醇溶液分別按1∶6、1∶7、1∶8、1 ∶9、1 ∶10（g/mL）的料液比混合，在 25 ℃下反應5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.2 乙醇濃度對游離油提取率的影響

牡丹籽粉分別與70%、75%、80%、85%、90%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在25℃下反應5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.3 反應溫度對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液分別在 15、25、35、45、55℃下反應5 h后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.2.4 反應時間對游離油提取率的影響

牡丹籽粉與80%的乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，混合液在 35 ℃下分別反應 4、5、6、7、8 h 后離心，所得渣相按照1.2.1的工藝條件堿提、酶解、離心后，取上層清油稱重，計算游離油提取率。

1.2.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對乙醇預處理階段中的料液比、乙醇濃度、反應溫度、反應時間4個因素進行正交試驗。每個因素選取3個顯著水平，以游離油提取率為指標，進行L9（34）乙醇預處理條件的正交試驗，因素水平表見表1。

表1 乙醇預處理條件的正交試驗設計表Table 1 Orthogonal experiment design of ethanol pretreatment conditions

1.3 分析方法

1.3.1 牡丹籽主要成分的分析

水分按照GB 5009.3-2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》執行；脂肪按照GB 5009.6-2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》執行；蛋白質按照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法執行；灰分按照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》執行。

1.3.2 牡丹籽游離油提取率的計算

式中：m為游離油質量，g；M為干燥牡丹籽質量，g；α為牡丹籽中脂肪的質量分數，%。

2 結果與分析

2.1 牡丹籽仁主要成分及含量

牡丹籽仁主要成分及含量見表2。

表2 牡丹籽仁主要成分及含量Table 2 Main components and content of peony seed kernel %

由表2可知，牡丹籽仁富含脂肪和蛋白質，而在水酶法工藝中蛋白質的乳化性會束縛油脂的游離。

2.2 單因素試驗

水酶法提取牡丹籽油，由于在水相體系中反應，牡丹籽自身磷脂、蛋白質、脂肪酸、小分子糖等物質會影響油脂的游離。其中，磷脂和蛋白質是良好的乳化劑，脂肪酸在堿性環境下生成表面活性劑脂肪酸鈉，而大量小分子糖的存在也會增加蛋白質的乳化性[16]。并且乙醇作為一種毒性較小、價格低廉、廣泛應用于工業化生產中的有機溶劑，一定濃度的乙醇溶液既可以使牡丹籽粉中磷脂、脂肪酸、小分子糖等物質溶出，又可以通過降低牡丹籽蛋白質的溶解性，防止由于較長時間的反應而形成的頑固乳化層。此外由于油脂不溶于極性溶劑乙醇，因而采用乙醇預處理水酶法提取牡丹籽油是對牡丹籽油沒有損失的。

2.2.1 料液比對游離油提取率的影響

料液比對游離油提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對游離油提取率的影響Fig.1 The influence of solid-liquid ratio on extraction rate of free oil

由圖 1可知，料液比在 1∶6（g/mL）～1∶8（g/mL）間，隨著料液比的增大游離油提取率增加很快，當料液比超過1∶8（g/mL）時，提取率變化不大。分析原因可能為，一定范圍內增加溶劑用量，使得牡丹籽粉內磷脂、脂肪酸、小分子糖等物質溶出增加，從而致使后續渣相堿提、酶解液內起乳化作用的物質減少，利于油脂游離，但當料液比達到一定程度時，牡丹籽粉中的磷脂、脂肪酸、小分子糖在乙醇中的溶解已比較充分，繼續增大料液比對游離油提取率沒有改善，同時考慮成本，選擇最佳料液比為1∶8（g/mL）。

2.2.2 乙醇濃度對游離油提取率的影響

乙醇濃度對游離油提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對游離油提取率的影響Fig.2 The influence of ethanol concentration on extraction rate of free oil

由圖2可知，游離油提取率隨乙醇濃度的增加逐漸增加，當乙醇濃度達到80%時游離油提取率最高。分析原因可能為乙醇濃度越大，牡丹籽粉中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物質的溶出越充分，那么這些物質殘留在渣相中的量就越少，利于渣相在堿提酶解過程中油脂的游離。但過高的乙醇濃度，游離油提取率反而降低，這是因為水對物料的溶脹作用，該作用能增大物料與溶劑的接觸面積[17]，較高的乙醇濃度含水量較少，牡丹籽粉溶脹不充分，從而使得磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出不充分，反而較多的殘留在渣相，最終導致游離油提取率降低。因此，最佳乙醇濃度為80%。

2.2.3 反應溫度對游離油提取率的影響

反應溫度對游離油提取率的影響見圖3。

由圖3可知，游離油提取率隨乙醇溶液溫度升高，呈現先增加后減少的趨勢，在35℃時提取率最高。分析原因可能為，溫度升高磷脂、小分子糖、脂肪酸在乙醇溶液中的溶解增加，但當溫度超過35℃，由于卵磷脂在乙醇中的溶解過程是放熱反應，溫度升高卵磷脂溶解度降低[18]，因而渣相殘留的卵磷脂增多，導致在堿提酶解階段較多的油脂被束縛無法游離。因此最佳溫度為35℃。

圖3 反應溫度對游離油提取率的影響Fig.3 The influence of temperature on extraction rate of free oil

2.2.4 反應時間對游離油提取率的影響

反應時間對游離油提取率的影響見圖4。

圖4 反應時間對游離油提取率的影響Fig.4 The influence of time on extraction rate of free oil

由圖4可知，隨著反應時間的延長，游離油提取率越來越大，超過7 h后提取率增長不顯著。分析原因可能為，維持提取過程進行的推動力是有效成分的濃度差，提取開始時，固液濃度差很大，擴散推動力大，磷脂、小分子糖、脂肪酸的溶出逐漸增加，這些物質在渣相中的含量逐漸越少，從而促使游離油提取率增加；但是隨著時間的延長，渣相和乙醇提取液兩相中磷脂、小分子糖、脂肪酸等物質的濃度達到或接近平衡，游離油提取率也基本維持穩定。因此，最佳反應時間為7 h。

2.3 乙醇預處理條件的正交試驗

根據單因素試驗情況，以游離油提取率為指標，對主要影響因素乙醇溶液料液比（A）、乙醇濃度（B）、反應溫度（C）、反應時間（D）4個因素每個因素選取3個顯著水平進行L9（34）的正交試驗，試驗結果見表3。

由表3的極差分析可知，在乙醇預處理階段中各因素對牡丹籽游離油提取率的影響依次為乙醇濃度＞反應溫度＞料液比＞反應時間，最佳提取條件為A2B2C2D2，即料液比為 1 ∶8（g/mL）、乙醇濃度為 80%、乙醇溶液溫度為35℃、處理時間7 h。

表3 正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results

2.4 優化工藝重復性考察

為驗證水酶法提取牡丹籽油的最佳乙醇預處理工藝條件，準確稱取50、100、200 g的牡丹籽粉3份分別與80%乙醇溶液按1∶8（g/mL）的料液比混合，在35℃下反應7 h后離心，所得渣相按1.2.1的具體工藝堿提、酶解、離心。3份牡丹籽樣品的游離油提取率依次為90.29%、90.34%、90.31%，平均值為90.31%。經測定所制備的牡丹籽油中乙醇殘留符合牡丹籽油行業標準，即小于10 mg/kg。因此，該提取條件合理、重復性好。

3 結論

本研究采用乙醇預處理水酶法提取牡丹籽油，在本課題前期研究所得牡丹籽最佳堿提、酶解條件的基礎上，通過單因素試驗和正交試驗優化了乙醇預處理的工藝條件，所得最佳提取牡丹籽油工藝條件為：乙醇溶液料液比為1∶8（g/mL）、濃度為80%、反應溫度為35℃、反應時間為7 h。在此條件下，游離油提取率高達90.31%，且該工藝重復性較好，溶劑殘留符合牡丹籽油行業標準，與傳統的水酶法工藝相比，此方法游離油提取率得到了較大的提升。值得注意的是，申少斐[19]等發現牡丹籽仁中低聚芪類物質含量較高，劉普[20]等發現在油用牡丹脫殼餅粕中單萜苷類物質的含量遠大于其在牡丹籽殼中的含量，其中，芍藥苷的含量最高。同時，現已有研究使用70%左右的乙醇溶液從牡丹籽中提取低聚芪類[19]和芍藥苷[21]，并獲得了較高的提取率。因此，采用乙醇預處理水酶法提取牡丹籽油工藝，通過不斷地試驗，有望實現可以同時得到活性物質、油脂和水解蛋白，從而進一步實現牡丹籽的綜合開發。