基于自由基清除能力的桑椹活性成分群提取工藝優選及活性評價

蔡毅，孫振華，馬雯芳，吳劍麗，鐘珍林

（廣西中醫藥大學，廣西南寧530200）

桑椹是桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥果穗[1]。早在《爾雅》，《本草綱目》上便有記載，其鮮果可直接食用，晾曬干燥可做藥用，是歷史悠久的藥食兩用品，其性寒，有滋陰養血、生津、潤腸之功，治療血虛精虧，須發早白，傷津口渴之效[2]。現代藥理學研究表明，其具有抗氧化、抑菌、免疫調節、降血糖、降血脂等藥理作用[3-4]。近年對桑椹抗氧化作用的研究主要集中在其酚類成分的抗氧化活性評價[5-6]，未見有以抗氧化作用為評價指標，對桑椹抗氧化活性成分群提取工藝優化相關研究的報道。本文充分考慮多種成分的提取效率，以藥效為考察指標，通過正交試驗設計優化活性成分群的提取工藝，并對不同產地、不同流通地、采摘與市售桑椹的抗氧化活性進行評價，為相關產品的研究開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5810R離心機：德國Eppendorf公司；DP5系列超純水儀：法國密里博公司；UV 2600紫外可見光分光光度計：日本島津公司。

DPPH試劑（批號：6 KCYN-LT）：日本東京化成工業株式會社；甲醇、乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

從全國各地采集桑椹藥材30批，經廣西中醫藥大學滕建北教授鑒定為桑科植物桑的干燥成熟果穗。從廣西、四川等桑椹主產區采摘藥材15批，從四川、江蘇等省區購買市售桑椹藥材15批。藥材信息表見表1，全部批次樣品經干燥處理后粉碎，過24目篩，備用。

表1 桑椹藥材信息表Table 1 Information of Mori Fructus

續表1 桑椹藥材信息表Continue table 1 Information of Mori Fructus

1.2 方法

1.2.1 繪制標準曲線

精密稱取DPPH試劑19.76 mg，置于100 mL容量瓶中，加90%甲醇至刻度，配置成0.5 mmol/L的DPPH溶液，再依次稀釋成0.4、0.3、0.2、0.1 mmol/L的溶液，以90%甲醇為空白對照，在517 nm處測定，得到以濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標的回歸方程。

1.2.2 DPPH溶液的制備

精密稱取DPPH試劑39.45 mg，配置成0.4 mmol/L的DPPH溶液，備用。

1.2.3 單因素考察

1.2.3.1 提取溶劑考察

精密稱取桑椹藥材（S10）9份，各0.3 g，分別精密加入50%甲醇、50%乙醇、純水各20 mL，超聲提取（400 W，40 kHz）30 min，濾過，得到提取原液。取過濾原液逐步稀釋，得到原液，以及 1/2、1/4、1/6、1/8、1/16、1/32、1/64倍原液濃度，8組不同濃度的供試品溶液。

分別精密移取1 mL提取溶劑，加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液中，混勻，以90%甲醇為空白參比，測定吸光度值A0。

分別精密移取1 mL供試品溶液加入到3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光反應30 min，以90%甲醇為空白參比，測定吸光度值A1。

分別取1 mL供試品溶液加入到3 mL 90%甲醇中，混勻，以90%甲醇為空白參比，測定吸光度值A2。

1.2.3.2 乙醇濃度考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，加入30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、乙醇各20 mL，超聲提取（400 W，40 kHz）30 min，濾過，分別測定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統計軟件計算IC50。

1.2.3.3 提取時間考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，分別以超聲提取處理 20、30、40 min，分別測定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統計軟件計算IC50。

1.2.3.4 溶劑用量考察

精密稱取桑椹藥材（S10），各0.3 g，分別精密加入50%乙醇 20、25、30 mL，分別測定 A0、A1、A2，用 SPSS 21.0統計軟件計算IC50。

1.2.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上選擇優化后的試驗因素，以IC50值為評價指標，按照L9（34）正交表進行試驗優化各因素水平，考察乙醇濃度、溶劑用量、提取時間對半數清除率的影響，以抗氧化效應為考察指標，確定最佳提取工藝條件，因素-水平表見表2。

表2 正交試驗因素-水平表Table 2 The factors and levels of orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 繪制標準曲線

以濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，得到回歸方程，Y=9.441 57X+0.113 283，r2=0.999 16，表明在0.1 mmol/L～0.5 mmol/L的濃度范圍內，濃度與吸光度呈良好線性關系，線性關系圖見圖1。

圖1 線性關系圖Fig.1 Linear diagram

2.1.2 提取溶劑考察

提取溶劑考察表結果見表3。

由表3可知，乙醇相較于甲醇和水提取液IC50值更小，抗氧化能力更優，且考慮乙醇無毒性，用乙醇提取更為安全，因此，采用乙醇作為提取溶劑。

表3 提取溶劑考察表Table 3 Solvent extraction research

2.1.3 乙醇濃度考察

乙醇濃度考察表見表4。

表4 乙醇濃度考察表Table 4 Ethanol concentration research

由表4可知，50%乙醇提取液IC50值最小，為0.078，因此采用50%乙醇作為提取溶劑。

2.1.4 提取時間考察

提取時間考察結果見表5。

表5 提取時間考察表Table 5 Extracting time research

由表5可知超聲提取30 min的IC50較小，抗氧化能力較強，因此提取時間選定為30 min。

2.1.5 溶劑用量考察

溶劑用量考察結果見表6。

表6 溶劑用量考察表Table 6 Solvent dosage research

由表6可知，當溶劑用量為20 mL時IC50值較小，抗氧化能力較優，因此溶劑用量為20 mL。

2.2 正交優化結果與分析

綜合單因素試驗結果，按照1.2.4項下正交試驗設計，正交試驗設計及結果分析見表7，方差分析結果見表8。

表8 方差分析結果Table 8 Variance analysis

由表7、表8可知，試驗最佳工藝組合為A2B1C2，K值最優為A2B1C1；正交試驗統計結果分析表明，A（乙醇濃度）、B（溶劑用量）兩個因素對桑椹羥基自由基半數清除率IC50有顯著影響，且各因素影響的程度依次為：B（溶劑用量）＞A（乙醇濃度）＞C（提取時間）。

為進一步確定最佳提取工藝，比較直觀分析所得提取工藝與正交試驗分析得到的桑椹抗氧化活性成分群最佳提取工藝，進行驗證性試驗，結果見表9。

表9 最佳工藝的驗證試驗（n=3）Table 9 Optimum process validation research

驗證性試驗結果表明，工藝組合A2B1C2的羥基自由基半數清除率IC50值更低，即抗氧化能力更強，確定最佳提取工藝為50%乙醇20 mL超聲提取30 min。

2.3 不同批次桑椹抗氧化活性測定

分別稱取各批次桑椹藥材（50目）各0.3 g，精密稱定，精密加入50%乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液1 mL與3 mL 0.4 mmol/L的DPPH溶液混勻，避光反應30 min，以90%甲醇為空白參比，在517 nm處分別測定 A0、A1、A2，并計算 IC50，30 批次不同產地、不同流通地、采摘與市售不同藥材羥基自由基半數清除率IC50在0.041～0.456之間，抗氧化作用良好，測定結果見表10。

表10 不同批次桑椹藥材抗氧化作用測定結果（n=3）Table 10 Antioxidant activity determination results of all batches of Mori Fructus

3 結論

人體的自由基是不斷地產生和消除的過程，衰老自由基理論認為自由基攻擊細胞成分，引發衰老的一系列損傷，自由基與生物體的壽命存在強相關關系[8]。DPPH是一種穩定的氮中心自由基，在溶液中顯深紫色，其可以捕獲氧化劑的自由基，與自身孤電子配對，使顏色變黃、變淺，且變化程度與自由基清除率呈線性關系，是評價天然抗氧化劑的一種常用方法[9-10]。

本文以桑椹抗氧化作用為考察指標，采用DPPH法，以羥基自由基半數清除率IC50測定指標，在單因素考察的基礎上采用正交設計法，以乙醇濃度、溶劑用量、提取時間為考察因素，優化建立桑椹活性成分群提取工藝，確定桑椹自由基清除能力最佳的活性成分群提取工藝為50%乙醇20 mL超聲提取30 min，經驗證該工藝穩定可行，試驗結果明確了50%乙醇提取物是桑椹發揮抗氧化作用的最佳活性部位。對不同產地、不同流通地、采摘與市售桑椹的抗氧化活性進行評價，各批次桑椹羥基自由基半數清除率IC50在0.041～0.456，抗氧化作用良好。廣西來賓市采摘味甜的桑椹抗氧化性最強，但綜合全部采摘與購買的桑椹樣品抗氧化作用無明顯差異，酸、甜不同的口感與抗氧化作用間沒有直接的相關性。

本文采用DPPH法基于自由基清除能力考察建立了桑椹活性成分群提取的最佳工藝，并對不同批次桑椹樣品抗氧化效應進行測定，為后期相關產品的研發奠定基礎。