基于廣泛代謝組學的云南榧子營養成分分析

周炳江，李靖，馬長樂，*，張金麗

（1.西南林業大學園林園藝學院，云南昆明650224；2.云南省高校園林植物與觀賞園藝重點實驗室，云南昆明650224；3.西南林業大學生命科學學院，云南昆明650224）

云南榧樹（Torreya yunnanensis）為我國云南省特有植物，屬于第三紀孑遺植物，且已列為國家二級瀕危保護植物，現主要分布在云南省的維西、麗江、貢山、中甸等高山地帶[1-3]。云南榧子具有食藥價值，民間常用其種子作中藥材使用，具有殺蟲、消積、潤腸、通便的功效[4]。

目前，國內外對云南榧子營養研究較少，馬長樂等[5]對云南榧子和香榧子的油脂、蛋白和礦質元素含量進行了對比研究，得出云南榧子同樣富含蛋白質和礦質元素。陳振德等[6]用重量法和氣相色譜法對榧屬植物的油含量及其脂肪酸組成，其結果表明云南榧子含油率（50.27%）及不飽和脂肪酸（占總脂肪酸76.1%）含量較高。此外，陳正德等[7]還對不同產地云南榧子中多糖進行了含量測定分析，云南榧子多糖含量較高及多糖組成較簡單。以往研究中大多對云南榧子的幾類營養物質進行研究，并未全面了解其營養成分，因此利用代謝組學對其營養價值進行全面研究是至關重要的。

代謝組學是通過核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）以其與質譜（mass spectrometry，MS）聯用等技術手段，采用組學分析方法，研究不同樣本的所有代謝物差異分析，具有耗時短，準確度高，廣覆蓋的特點[8-11]。其中廣泛靶向代謝組學是結合了非靶向代謝組學和靶向代謝組學的優點，基于廣泛靶向代謝組數據庫，采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，定性、定量樣本中代謝物檢測方法，具有高效、高靈敏、高覆蓋的特點[12-13]。因此，可利用代謝組學對食品進行代謝產物的鑒定與分析，有助于全面了解食品的營養價值[14-15]。

本研究為全面了解云南榧子營養成分，促進云南榧子營養價值的開發，以野生云南榧子作為研究對象，利用廣泛靶向代謝組學分析方法與超高效液相色譜串聯質譜技術，對云南榧子代謝物進行成分鑒定與分析，為云南榧樹的種植推廣和保護利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Shim-pack超高效液相色譜：日本島津公司；6500 QTRAP串聯質譜：美國Applied Biosystems公司；MM 400研磨儀：德國Retsch公司。甲醇、乙腈、乙醇（色譜純）：德國Mark公司。云南榧子于2017年9采自云南省迪慶州維西縣（海拔2 190 m），選取飽滿無壞的種子進行晾干處理，于室溫（15℃～25℃）下貯藏備用。

1.2 方法

將云南榧子于真空冷凍干燥，用研磨儀研磨（30Hz）1.5 min，直至粉末狀；準確稱取100 mg的粉末，溶解于1.0 mL 70%甲醇水中，在4℃冰箱過夜，期間渦旋3次，提高提取率；10 000 g離心10 min后，取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，于進樣瓶保存，用于超高效液相色譜-串聯質譜分析。

1.2.1 液相條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×100 mm×1.8 μm）；流動相：水相為超純水（加入0.04%的乙酸），有機相為乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脫梯度：0 min水/乙腈（95∶5，體積比），11.0 min為5∶95體積比，12.0 min為5∶95體積比，12.1 min為95∶5體積比，15.0 min為95∶5體積比；流速0.4 mL/min；柱溫 40 ℃；進樣量 2 μL。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度500 ℃，質譜電壓 5 500 V，簾氣（curtain gas，CUR）25 psi，碰撞誘導電離（collision-activated dissociation，CAD）參數設置為高。在三重四級桿（triple quadrupole，QQQ）中，每個離子對是根據優化的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能（collision energy，CE）進行掃描檢測。

1.3 數據處理

質控樣本：質控樣本（quality control samples，QC）由3組云南榧子提取物等量混合制備而成，3個重復，與分析樣本采用相同的方法處理和檢測。在儀器分析的過程中，每10個檢測分析樣本中插入一個質控樣本，以監測分析過程的重復性。

定性分析：基于武漢邁特維爾生物科技有限公司自建數據庫（MetWare數據庫V3.3）及代謝物公共數據庫，根據二級譜信息對代謝物定性。

半定量分析：利用三重四級桿質譜的MRM分析完成定量，采用峰面積歸一法計算個代謝物成分相對百分含量。

相對含量/%=M/N×100

式中：M為代謝物的峰面積；N為總峰面積。

2 結果與分析

2.1 樣本質控結果

通過超高效液相色譜-串聯質譜對云南榧子代謝物進行分析，得到總離子流圖見圖1。總離子流的曲線峰值保留時間和峰強度基本一致。這表明質譜對同一樣品的不同時間檢測時，信號較為穩定。說明此方法對云南榧子測定出的代謝物數據結果可靠。

2.2 代謝物成分組成

云南榧子共檢測鑒定出440種代謝物，按其特性共分為8類見圖2、表1。

圖1 QC樣本質譜檢測總離子流圖的疊加圖Fig.1 Overlap total ion of quality control samples

圖2 云南榧子物質的相對含量與數量Fig.2 Relative content and quantity of material seed of Torreya yunnanensis

表1 云南榧子代謝物成分列表Table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

續表1 云南榧子代謝物成分列表Continue table 1 List of metabolites in seeds of Torreya yunnanensis

由圖2可知，其中有機酸類121種，占總含量的33.75%；氨基酸類93種，占總含量的15.95%；脂類57種，占總含量的12.95%；其他類42種，占總含量的12.85%；核苷酸類60種，占總含量的11.05%；醇類20種，占總含量的6.19%；維生素類16種，占總含量的4.36%；糖類20種，占總含量的2.87%；吲哚類11種，占總含量的0.97%。

由表1可知，占總量1%以上的代謝物分別有：有機酸類9種：甲基蘋果酸（3.898 8%）、磷酸（3.642 1%）、木糖酸（2.764 4%）、甲基丙二酸（2.582 3%）、琥珀酸（2.543 5%）、沒食子酸甲酯（2.253 9%）、D-半乳糖醛酸（2.185 2%）、2-吡啶甲酸（1.3464%）、3，5-二羥基-3-甲基戊酸（1.131 4%）；核苷酸類3種：鳥苷（1.788 2%）、尿嘧啶（1.755 3%）、6-甲基巰嘌呤（1.370 2%）；氨基酸類5種：L-纈氨酸（1.886 7%）、DL-正纈氨酸（1.713 6%）、L-異亮氨酸（1.241 9%）、L-亮氨酸（1.218 0%）、DL-脯氨酸（1.134 4%）；脂類2種：溶血磷脂酰膽堿20：4（2.588 2%）、溶血磷脂酰膽堿 18：0（2.143 4%）；醇類2種，2-癸醇（1.9385%）；1-癸醇（1.8718%）；糖類1種：肌醇半乳糖苷（1.1792%）；維生素類1種：吡哆素（VB6，1.349 4%）；其它物質1種：4-硝基苯酚（8.985 7%）。

2.3 營養物質成分分析

從檢測結果得知（圖2，表1），在云南榧子中物質相對含量與種類最多的為有機酸類，其次為氨基酸類。基礎氨基酸中僅甘氨酸未被測出，占氨基酸類的39.92%，其中組成甘氨酸的抗氧化劑與還原性谷胱甘肽分別占氨基酸類的0.31%和0.10%。氨基酸類主要成分為L-纈氨酸（11.83%）、DL-正纈氨酸（10.75%）。L-纈氨酸是人體必需氨基酸之一，缺乏時會引起神經障礙、發育停止、體重下降、貧血等及其他一系列生理問題，同時L-纈氨酸也可作營養增補劑、配制復合氨基酸輸液、食品添加劑等[16]。此外，F值是支鏈氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸）與芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸）的物質含量比值，高F值具有輔助治療肝性腦病、保肝、護肝、治療苯丙酮尿癥、抗疲勞、防衰老等作用，正常人血液的F值在3.5%～4.0%，肝病病人的F值低于2.5%，而云南榧子的F值為5.73%，對于肝病病人有著重要的食用價值[17]。云南榧子中的氨基酸類總量高，種類全，具有較高的營養價值，必需氨基酸占氨基酸類的33.15%，使人體易于吸收利用。一般在研究營養物質時，主要研究L-型氨基酸。在本研究中采用超高效液相色譜串聯質譜技術，檢測出D、DL型的氨基酸與非基礎氨基酸，這些氨基酸同樣具有豐富的營養功能[18]。

云南榧子脂類含量豐富，主要為磷脂類和脂肪酸類。磷脂不僅有較高的營養價值，同時還具有促進人體新陳代謝、預防疾病、增強免疫力等作用[19]。檢測結果顯示，云南榧子中的溶血磷脂酰膽堿共鑒定出20種，可作為食品添加劑、抑菌劑和乳化劑，在醫療及免疫學方面的研究意義重大[20-21]。此外，還鑒定出14種脂肪酸，其含量占脂類的19.28%。云南榧子的脂肪酸中含12種不飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸含量占脂類的19.02%，占脂肪酸的98.69%，比陳振德等[6]所報道的76.1%還要高，可能是飽和脂肪酸的山俞酸和棕櫚酸未被檢測出來。本研究中，不飽和脂肪酸主要種類（占總脂肪酸）有十八碳-9E，13E，15Z-三烯酸（30.02%）、石榴酸（27.45%）、順-11-二十碳烯酸（12.69%）、α-亞麻酸（7.79%）、亞油酸（0.23%）等；其飽和脂肪酸有2種，占總脂類的0.26%，占總脂肪酸0.26%，主要種類（占總脂肪酸）有花生酸（0.30%）、木蠟酸（1.02%）。云南榧子的不飽和脂肪酸含量較高，其不飽和脂肪酸是人體必需的營養物質，在人體內起至關重要的作用，一旦缺少就會導致各種疾病的產生。它具有調節血脂、降低膽固醇、降低高血壓、抗腫瘤、預防癌癥等功效[22-23]，其中石榴酸具有防治高血脂癥、心腦血管疾病、抗腫瘤等效果[24]。

鑒定結果顯示，云南榧子鑒定出的維生素類含量最多的為B族維生素（7種，占維生素類的87.66%），其中含量最高的是維生素B6，占維生素類的30.93%。B族維生素與維生素C（占維生素類的0.73%）為水溶性維生素，水溶性維生素具有改善患者心臟功能、改善睡眠的作用，為常見營養強化劑[25-27]。在云南榧子的糖類中肌醇半乳糖苷相對含量最高，占鑒定出的糖類的41.11%，是構成保護植物免受氧化損傷成分之一[28]，并能通過棉籽合酶的作用，與蔗糖轉化成低聚糖棉子糖[29]，在食品有著非常重要的作用。

鑒定結果進一步顯示，除前面常見營養物質外，云南榧子中有機酸種類豐富而使其具有獨特的風味。云南榧子鑒定出的有機酸中相對含量最高的香味物質為香蘭素（占有機酸類2.76%），具有香莢蘭香氣及濃郁的奶香，用途十分廣泛，被稱為“食品香料之王”[30]；同時醇類物質也是云南榧子香味的重要來源之一，1-癸醇（占醇類30.24%）具甜的玫瑰脂蠟香，略有甜橙花、鈴蘭花氣息[31]。

3 結論

本研究以野生的云南榧子為研究對象，利用廣泛代謝組學技術對云南榧子進行營養價值的評價，總共鑒定出440種代謝物。其中有機酸類的相對含量與數量最高，共121種，占總含量的33.75%，其次為氨基酸類93種（15.95%）；脂類 57種（12.95%），位于第三大類，其必需氨基酸含量較高，占氨基酸類的33.15%；脂肪酸占脂類的19.27%，不飽和脂肪酸占脂肪酸的98.69%；維生素類16種，占總含量的4.36%，其水溶性維生素（B族維生素與維生素C）占維生素類的88.39%；糖類有20種，占總含量2.87%，這些營養物質種類豐富，使云南榧子擁有豐富的營養；云南榧子中香蘭素與1-葵醇含量較高，分別占有機酸類與醇類的2.76%、30.24%，可能是組成云南榧子獨特的風味重要因素之一。

此次試驗，微量元素雖未測定，但在科研組[5]前期測定的結果來看，云南榧子富含礦質元素，為典型的高鉀低鈉食品。以上這些結果都表明云南榧子的營養物質豐富，云南榧子是很好的野生食用植物資源，可加工成零食干果，未來可進一步推動其自然野生資源的開發利用與保護。