酶解制備苦蕎蛋白抗氧化肽及其分離純化研究

陳金玉，曲金萍，張坤生，閆怡君，任云霞

（天津市食品生物技術重點實驗室，天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津300134）

苦蕎麥又被稱為三角麥，是一種糧藥兼備的資源[1]。苦蕎麥最早起源于中國，在中國各地均有種植，其面積和產量居世界第二位。蕎麥尤其是苦蕎麥，在所有糧食作物中，不僅具有較高的營養價值，還含有其他糧食作物所缺少的藥用成分和特種微量元素。苦蕎麥含有多種生物活性成分，具有較高的營養價值和保健功能，對絕大多數中老年心腦血管和現代“文明病”均有預防和治療作用[2]。

已有文獻報道，苦蕎蛋白具有一系列顯著的生理功效，如降低膽固醇、改善便秘、調節血糖和血脂、抑制脂肪蓄積和預防腫瘤等[3]，而這些保健功效很可能與苦蕎蛋白的消化特性有關[4]。苦蕎蛋白的氨基酸組成比較均衡，約含有17種氨基酸，其中8種為人體必需氨基酸。在這8種必需氨基酸中，除亮氨酸外，剩余大多數氨基酸含量都高于小麥粉和玉米，尤其以一般植物缺乏的賴氨酸和精氨酸最為豐富，這兩種氨基酸恰恰是組成人體血液即血漿蛋白的主要成分[5-6]。苦蕎蛋白的制備方法主要有堿溶酸沉法[7]、乙醇提取法、酶解法等。研究表明，蛋白水解得到的多肽具有一系列顯著的生理生物活性，如抗氧化[8]、降血壓、抗凝血、抗腫瘤、抗菌、提高免疫力等[9]，因此研究苦蕎蛋白水解產物對于進一步開發苦蕎新功能產品具有潛在的市場價值和應用前景[10]。

本文以DPPH自由基清除能力為評價指標，篩選酶法制備苦蕎蛋白抗氧化肽的最適酶。在此基礎上，以水解度為指標，利用單因素和響應面模型分析法優化酶解工藝條件，而后進一步利用超濾法、凝膠過濾色譜法對苦蕎蛋白水解物進行分離純化，考察不同級份的抗氧化活性。試驗結果為深入探究苦蕎蛋白水解物的抗氧化活性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石油醚（30℃～60℃沸程）：天津市風船化學試劑科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：上海麥克林生化試劑有限公司；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、2'-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）、牛血清蛋白：Sigma試劑公司；葡聚糖凝膠（G-15）：北京索萊寶試劑有限公司。

SHB-Ⅲ循環水式真空泵：鞏義市毛華儀器有限公司；BECKMAN COULTER離心機：美國貝克曼庫爾特有限公司；FD-A-50冷凍干燥機：上海皓莊儀器有限公司；IKA T10高速組織勻漿機：艾卡（廣州）儀器設備有限公司；A2004A電子天平：上海精天儀器有限公司；HITACHI U-5100型分光光度計：日立高新技術公司；EL20 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司；超濾離心管：美國Millipore有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦蕎蛋白的提取

參考李宗杰[11]的方法，將苦蕎麥粉按料液比1∶2（g/mL）加入30℃～60℃沸程的石油醚中，置于通風櫥中不斷攪拌，待大部分石油醚揮發后，用布氏漏斗過濾，并在通風櫥中晾干，得到脫脂蕎麥粉。將干燥的脫脂蕎麥粉與蒸餾水按1∶10（g/mL）混合，調節pH值為8.0，在 50℃下水浴 30min。離心（9000r/min）20min，收集上清液并調節pH值為4.5（苦蕎蛋白等電點約為4.5），再次離心得到沉淀。沉淀物用去離子水多次沖洗后調節其pH值為7.0，真空冷凍干燥，即為苦蕎蛋白。

1.2.2 水解產物的制備

稱取適量苦蕎蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液（pH 7）中，樣品濃度為2%，勻漿30 s，調節pH值，加入一定量酶進行水解。結束后，將酶解液置于沸水中滅酶10 min，冷卻至室溫（25℃），調節反應液pH值為4.5，離心（5 500 r/min）15 min，取上清液，真空冷凍干燥得到酶解產物粉末。

1.2.3 蛋白酶的篩選

分別采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對提取的苦蕎蛋白進行水解，以抗氧化活性為指標篩選最佳用酶。各酶水解的條件見表1。

表1 各酶較適宜的水解條件[12]Table 1 The suitable hydrolysis conditions of each enzyme[12]

1.2.4 單因素試驗

1.2.4.1 時間對苦蕎蛋白水解度的影響

以1.2.3中篩選的酶為最適酶進行水解，酶與底物添加質量比為1∶50，調節反應體系pH值至2.0，置于37℃恒溫水浴鍋中水解 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 后，迅速放入沸水浴中滅酶10 min，考察反應時間對水解度的影響。

1.2.4.2 溫度對苦蕎蛋白水解度的影響

選擇1.2.4.1中篩選的最佳反應時間，調節pH值至2.0，酶與底物添加質量比為1∶50，分別置于23、30、37、44、51℃水浴鍋中水解2.0 h，反應結束后沸水浴滅酶，考察溫度對水解度的影響。

1.2.4.3 pH值對苦蕎蛋白水解度的影響

選擇1.2.4.1和1.2.4.2中篩選的最佳反應時間和溫度，酶與底物添加質量比為1∶50，調節pH值分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0，置于 37 ℃恒溫水浴鍋中酶解2.0 h，反應結束后沸水浴滅酶，考察pH值對水解度的影響。

1.2.5 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken設計原理，以水解度值為響應指標，以pH值、溫度和時間為響應因子，進行三因素三水平響應面試驗設計，確定苦蕎蛋白多肽制備的最佳工藝條件。試驗因素水平表見表2。

表2 響應面試驗因素水平編碼表Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 水解度的測定

將水解液與等體積20%三氯乙酸溶液混合，離心（1 600 r/min）30 min，取上清液 1 mL于試管中，加入4 mL雙縮脲試劑，劇烈振蕩后，放置30 min，于波長540 nm測定吸光度值。以牛血清蛋白為標準蛋白質[13]。苦蕎蛋白的水解度計算公式如下：

水解度/%=上清液蛋白濃度/總蛋白濃度×100

1.2.7 超濾分離

苦蕎蛋白水解物通過UF超濾膜（截留分子量為3 kDa）進行超濾，超濾條件為：25℃、離心轉速4 500 r/min、30 min，收集濾過液（＜3 kDa）和未濾過液（＜3 kDa），并分別測定兩種級分的DPPH自由基清除率，選取抗氧化活性強的級分冷凍干燥，于-20℃保存，繼續進行下一步凝膠色譜分離純化。

1.2.8 凝膠過濾色譜分離

將樣品配成一定濃度，取5 mL上樣于經超純水平衡后的葡聚糖凝膠（G-15）過濾柱，用超純水進行洗脫，流速為0.8 mL/min，自動收集器每6 min收集1管，分別檢測每管洗脫液的吸光度值（214 nm），并繪制洗脫曲線。收集各峰對應組分，測定其DPPH自由基清除率。

1.2.9 抗氧化能力測定

1.2.9.1 還原能力

取1mL待測溶液與0.2mL磷酸鹽緩沖液（0.2mol/L，pH 6.6）及1.5 mL 0.3%鐵氰化鉀溶液混合，50℃反應20 min。依次加入1 mL三氟乙酸（10%）、0.5 mL三氯化鐵（0.3%）和3 mL蒸餾水，搖勻，測定700 nm處吸光值。

1.2.9.2 DPPH自由基清除率

參考Zheng等[14]的方法并稍作修改。取2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液與2 mL樣品待測液，混合避光反應30 min后在517 nm處測吸光度值。空白組用乙醇代替DPPH溶液；對照組為無水乙醇代替樣品與DPPH乙醇溶液混合。計算公式如下：

式中：A1為試驗組吸光度；A2為空白組吸光度；A3為對照組吸光度。

1.2.9.3 ABTS＋自由基清除率

取0.2mL待測溶液于試管中，加入3.8mL的ABTS＋工作液（配置方法參考文獻[14]），室溫（25℃）避光反應6 min后，于734 nm處測定吸光值。計算公式如下：

式中：A1為樣品與ABTS＋反應后的吸光值；A2為樣品自身的吸光值；A3為未加樣品的ABTS＋吸光值。

1.2.10 數據處理與分析

所有試驗均重復3次，采用SPSS 19.0進行數據統計分析，并用Duncan多重比較檢驗各處理平均數之間的差異顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

不同酶水解產物的抗氧化活性見圖1。

圖1 不同酶水解產物的抗氧化活性Fig.1 Antioxidant activity of the corresponding products of each enzyme hydrolysis

由圖1可知，在3種酶的水解作用下，胃蛋白酶的水解產物清除DPPH自由基的能力最強，當胃蛋白酶濃度為1.5 mg/mL時，其自由基清除率最高達到71.25%，且隨著胃蛋白酶濃度的增加，水解產物的DPPH自由基清除率呈逐漸升高的趨勢。堿性蛋白酶水解產物的清除能力最低。胃蛋白酶水解產物清除DPPH自由基的能力優于胰蛋白酶和堿性蛋白酶，可能是因為每種酶的切割位點有較大差異，產生的多肽序列不同[15]，從而導致水解產物的最終抗氧化能力不同。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 時間對苦蕎蛋白水解度的影響

時間對苦蕎蛋白水解度的影響見圖2。

圖2 時間對苦蕎蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of time on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖2可知，隨著水解時間的延長，苦蕎蛋白的水解度呈現先升高后逐漸平緩的趨勢，在水解時間為2 h時其水解度較高，為26.21%。這可能是因為蛋白酶保持活力的時間是一定的，超過一定時間后，酶的活性會逐漸下降。此外，水解時間在2 h之前，蛋白沒有充分被水解；而2 h之后，苦蕎蛋白在酶的作用下基本被完全水解，且隨著底物消耗殆盡，反應進程增加緩慢，從而使水解度呈現平緩的趨勢。

2.2.2 溫度對苦蕎蛋白水解度的影響

溫度對苦蕎蛋白水解度的影響見圖3。

圖3 溫度對苦蕎蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖3可見，溫度對苦蕎蛋白水解反應的影響比較顯著，溫度過高或者過低對水解度均有負面影響。隨著溫度的升高，苦蕎蛋白水解度呈現先增高后降低的趨勢，當溫度為37℃時，水解度達到最大值（27.67%）。這可能是因為37℃為胃蛋白酶的最適溫度，此時可以最大程度的發揮胃蛋白酶的催化酶切效果；而過高或過低的溫度都會對酶的活力產生不利影響，不能使酶與底物充分結合，從而導致水解度較低[16]。

2.2.3 pH值對蕎麥蛋白水解度的影響

pH值對蕎麥蛋白水解度的影響見圖4。

圖4 pH值對蕎麥蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of pH on degree of hydrolysis of tartary buckwheat protein

由圖4可見，酶解pH在1.0～1.5之間時，苦蕎蛋白水解度隨著pH值的增加而增大，pH值為1.5時，蛋白水解度最大，為27.19%，說明該酸性條件最利于酶與底物相結合。當pH值大于1.5時，水解度明顯降低，可能是因為該pH值條件影響酶活性中心上必需基團的解離程度和催化基團中質子供體或質子受體所需的離子化狀態[17]，因此影響了酶與底物的結合，從而使苦蕎蛋白水解度降低。

2.3 響應面試驗設計及結果

根據單因素試驗結果，選取溫度、pH值、時間3個因素，以水解度作為響應值，進行三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface experiment

續表3 響應面試驗設計及結果Continue table 3 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert 7.0軟件對表3結果進行回歸分析，所得的方差分析結果見表4。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the response surface regression model

回歸模型的預測相關系數R2為0.979 5，校正相關系數 R2Adj為 0.953 1，該模型的 P＜0.000 1，表明該響應回歸模型達到了極顯著水平；失擬項P（0.078 1）＞0.05，不顯著。以上數據表明，得到的模型和試驗數據擬合度較好。根據回歸系數，得出苦蕎蛋白水解度的二次多元回歸方程為：Y=30.31＋3.21X1＋1.74X2＋1.88X3＋2.36X1X2＋2.08X1X3＋1.52X2X3-2.35X12-6.88X22-3.60X32。

回歸系數的顯著性分析結果表明，酶解溫度、pH值、時間對水解度的影響極顯著，時間與溫度交互項（X1X2）、時間二次項（X12）、溫度二次項（X22）、pH 值二次項（X32）對應響應值為極顯著；時間與pH值交互項（X1X3）、溫度與 pH 值交互項（X2X3）對應響應值為顯著。該回歸方程較好地描述了各變量因素與響應值水解度之間的真實關系，可通過該方程確定苦蕎蛋白酶解的最佳工藝條件。

在響應曲面上可根據圖的坡度反映各因素對水解度的影響[18]。根據回歸方程做出三維曲面及等高線圖，如圖5～圖7所示。

圖5 酶解時間與溫度的交互作用Fig.5 Interaction between enzymatic hydrolysis time and temperature

圖6 酶解時間與pH值的交互作用Fig.6 Interaction between enzymatic hydrolysis time and pH

圖7 酶解溫度與pH值的交互作用Fig.7 Interaction between enzymatic hydrolysis temperature and pH

圖5顯示當時間不變時，隨溫度的增加，水解度先增加后降低，變化幅度顯著（P＜0.01），且時間和溫度的等高線呈橢圓形，說明時間和溫度對水解度的交互作用顯著[19]。圖6顯示隨時間和pH值增加，水解度先增加后降低；pH值和溫度的等高線接近圓形，說明pH值和溫度的交互作用不顯著。圖7顯示水解度隨溫度與pH值的增加先升高后降低，溫度與pH值的等高線呈橢圓形，說明溫度與pH值的交互作用顯著，且等高線沿著pH值軸方向比溫度方向密集，說明pH值對水解度的影響比溫度顯著。

2.4 最佳工藝的驗證

利用Design Expert 7.0軟件得到苦蕎蛋白最佳酶解工藝：時間2.45 h，溫度38.61℃，pH 1.73。為方便實際操作，將最佳工藝條件設為：時間2.5 h、溫度38℃、pH 2.0。此條件下苦蕎蛋白的水解度達到（32.68±0.21）%，與理論預測值32.77%基本吻合，說明采用響應面法優化苦蕎蛋白酶解工藝是可行的。

2.5 超濾

超濾分離組分及其抗氧化活性見表5。

本試驗采用超濾離心管對制備的苦蕎蛋白水解物進行膜超濾分離，得到了2種分子量組成的抗氧化肽：I（＜3 kDa）和II（＞3 kDa）。其中級份I占58.3%，級份II占41.7%，由此可見，苦蕎蛋白水解物多肽主要以小分子量肽段（＜3 kDa）組成。試驗進一步采用DPPH法考察級份I和級份II的抗氧化能力，由表5可知，級份I（＜3 kDa）具有更低的IC50值，即低分子量組分的抗氧化活性較強，高分子量組分的抗氧化活性較弱。可能是因為小分子量多肽由于其肽鏈較短，導致空間位阻較小，因此內部的活性基團更容易暴露，便于其與自由基反應[20]。這與李華等[21]和王章存等[22]的研究結果類似。

2.6 凝膠過濾色譜

進一步將抗氧化活性較強的級份I進行凝膠過濾色譜分離，分離曲線見圖8。

圖8 凝膠過濾分離曲線Fig.8 Gel filtration separation curve

如圖8所示，級份I經凝膠色譜分離后得到3個峰。峰1最先被洗脫出來，保留時間較短，說明峰1的分子量較大，不能進入凝膠顆粒內部而最先流出凝膠柱[23]。峰2和峰3的保留時間較長，說明峰2和峰3組分分子量較小，在流經凝膠柱時進入顆粒內部從而延長洗脫時間。

2.7 凝膠分離各峰的抗氧化活性比較

凝膠分離各組分的抗氧化活性見表6。

表6 凝膠分離各組分的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of each component separated by gel chromatography

由表6可知，3種抗氧化評價體系均顯示峰3組分的抗氧化活性最強，其次是峰2，峰1的抗氧化能力最弱。結合圖8可以發現，峰3組分的強抗氧化活性可能與其分子量有關，小分子量酶解肽具有較好的抗氧化效果。

3 結論

本試驗以DPPH自由基清除率為指標，分別用堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶對提取的苦蕎蛋白進行酶解，得到胃蛋白酶為制備苦蕎蛋白抗氧化肽的最適酶。通過單因素和響應面試驗優化苦蕎蛋白水解工藝，得到最佳工藝條件：時間2.5 h、溫度38℃、pH 2.0，在此條件下苦蕎蛋白水解度為32.68%。采用超濾法和凝膠過濾色譜法對苦蕎蛋白水解物分離純化，結果表明，分子量＜3 kDa的水解物具有顯著的抗氧化活性，經凝膠色譜進一步分離得到3個峰組分，小分子量峰組分顯示出最強的抗氧化活性。本研究為后續試驗深入研究苦蕎蛋白抗氧化活性肽奠定良好基礎。