白腐真菌預處理對煤厭氧發酵產甲烷的影響

張懷文，黃 松，閆夏彤，趙樹峰，張洺潞，夏大平

白腐真菌預處理對煤厭氧發酵產甲烷的影響

張懷文，黃 松，閆夏彤，趙樹峰，張洺潞，夏大平

(河南理工大學 能源科學與工程學院，河南 焦作 454000)

為研究白腐真菌預處理對煤厭氧發酵產甲烷的影響，以預處理長焰煤為實驗組，未經預處理煤樣為對照組，在適宜環境下進行厭氧發酵產氣實驗。利用重鉻酸鉀法、紫外分光光度法、掃描電鏡等手段對產氣過程中的COD(化學需氧量)質量濃度、輔酶F420活性及煤形貌變化等進行階段性分析。結果表明：實驗組與對照組總產氣量和碳轉化率分別是2 322.0 mL與5.10%、1 330.2 mL與4.70%，且實驗組初始產氣時間明顯提前；實驗組降解更為徹底，兩者COD值分別是32~176 mg/L與576~609 mg/L；實驗組與對照組輔酶F420活性最高值分別為0.011 72 μmol/L和0.007 97 μmol/L，且其活性受TOC(總有機碳)含量和產酸細菌的影響；預處理和產氣結束后，實驗組煤樣表面更加粗糙，微生物吸附位點和吸附量也更多，且有菌簇的形成。實驗證實，白腐真菌生物預處理在提高煤厭氧發酵產氣量與碳轉化率方面具有很強的優越性和可適用性，有利于煤層生物氣資源的產業化利用。

長焰煤；生物預處理；白腐真菌；厭氧發酵；甲烷；河南義馬千秋礦

煤層氣是一種潛力巨大且尚未被完全開發的清潔能源，在世界能源結構中占有重要地位[1]。煤層氣的勘探開發不僅能夠減緩溫室效應，降低礦井通風成本，同時也能獲得高效清潔的甲烷能源，而微生物增產煤層氣(MECBM)技術是增加煤層氣資源量的重要途徑之一[2]。

一般來講，煤微生物厭氧降解產甲烷過程(MECBM技術核心)包括水解階段(發酵細菌、水解細菌)、產酸階段(產酸菌、同型產乙酸菌)、產甲烷階段(產甲烷菌)等多階段多菌群的協同完成[3-4]，且水解階段是整個過程的限速階段[5]。前期預處理是解決水解階段限速問題的重要方法之一，主要包括物理、化學及生物預處理等。研究表明，白腐真菌生物預處理是一種優異的預處理方式，能夠通過木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶等關鍵酶催化自由基鏈式反應，實現對木質素的礦化并將多聚糖降解為可利用的單糖[6-8]。白腐真菌具有降解復雜底物(參與生化反應的物質，發酵反應的原料就是底物，也相當于生化反應的反應物)的能力，且降解范圍廣、反應條件溫和、適應性強，是對煤炭進行生物降解和加工的一種新型研究方向[9-10]。白腐真菌對煤的降解包括氧化和氫化兩個過程，不僅可以將部分煤樣降解為氣態小分子物質，而且有利于煤質的精選和燃燒特性的優化[11]。徐一雯等[12]研究了超聲、微波及熱堿預處理技術對廚余垃圾厭氧發酵產甲烷的影響；夏大平等[13]研究了酸、堿預處理后煤發酵聯產氫氣–甲烷生成特征與煤結構變化；張亦雯等[14]研究了3種不同H2O2濃度預處理中、高階煤的生物甲烷生成潛力，發現0.05%H2O2直接注入煤層或將預處理液注入煤層均可實現生物甲烷的增產。

目前聲波、酸堿、氧化劑等物理、化學等多種預處理方式對煤發酵產氣的影響已多有報道[15-17]，但鮮有報道生物預處理煤樣的產氣特征。鑒于此，分別對白腐真菌預處理和未進行預處理的長焰煤進行生物發酵產甲烷實驗，研究分析產甲烷過程中不同階段產氣量、化學需氧量(COD)、輔酶F420活性及煤表面結構變化等規律，為進一步證實白腐真菌生物預處理的優越性和煤層生物氣資源的商業化利用提供支撐和借鑒。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

煤樣選自河南義馬千秋礦，煤的鏡質體最大反射率為0.56%，為長焰煤。煤層埋深500 m，儲層溫度25°C。在采煤工作面人工采集塊狀煤樣(＞8 cm× 8 cm × 8 cm)后放在氦氣填充密封的低溫厭氧罐內，并及時運往實驗室密封保存。煤樣的工業分析和元素分析結果見表1。

產氣菌源來自焦作古漢山礦井水。在采煤工作面涌水口處人工采集新鮮水樣，通入氦氣后運往實驗室冷藏保存。白腐真菌由河南理工大學煤層氣生物工程實驗室提供。

表1 義馬千秋礦長焰煤的工業分析和元素分析

1.2 實驗方案

以白腐真菌預處理煤樣為實驗組，未經預處理煤樣為對照組，其他條件均保持一致。實驗前將煤樣破碎篩分至100~150目(0.1~1.5 mm)，并儲存在干燥樣品袋內。產氣實驗在3 000 mL發酵瓶中進行，產生的氣體通過排飽和食鹽水法集于集氣瓶中(圖1)。主要實驗流程如下。

a. 配置微量元素液 1.5 g氨基三乙酸，0.5 g MnSO4·2H2O，3.0 g MgSO4·7H2O，0.1 g FeSO4·7H2O，1.0 g NaCl，0.1 g CoCl2·6H2O，0.1 g CaCl2·2H2O，0.01 g CuSO4·5H2O，0.1 g ZnSO4·7H2O，0.01 g H3BO3，0.01 g KAl(SO4)2，0.02 g NiCl2·6H2O，0.01 g Na2MoO4與1 000 mL超純水。

b. 配置產甲烷富集培養基 1.0 g NH4Cl，0.1 g MgCl2·6H2O，0.4 g K2HPO4·3H2O，0.2 g KH2PO4，1.0 g酵母膏，0.001 g刃天青，0.5 g L–半胱氨酸鹽，0.2 g Na2S，2.0 g NaHCO3，2.0 g乙酸鈉，2.0 g甲酸鈉，0.1 g胰蛋白胨，10 mL微量元素液與1 000 mL礦井水。

c. 配置白腐真菌富集培養基 200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，5 g蛋白胨與1 000 mL超純水，并將白腐真菌菌種接種到PDA固體培養基上。

將配置好的白腐真菌和產甲烷培養基在(35± 0.5)°C恒溫培養箱內富集培養4~5 d。富集培養完成后向富含白腐真菌的發酵瓶內加入100 g新鮮煤樣，好氧預處理6~7 d。預處理結束后，保留煤顆粒沉淀物并用KOH溶液中和預處理發酵液，同時向預處理發酵瓶內加入同質量、同粒度的煤樣及1 000 mL產甲烷富集液，輕輕搖晃至混合均勻，在預處理裝置基礎上形成產甲烷裝置。

實驗裝置如圖1所示。

在液體取樣口4每隔3 d抽取一次菌液，置于50 mL離心管內，并向離心管內充入氦氣以保證其厭氧條件，用封口膜密封后放置在4°C冰箱內冷藏保存。

1—發酵瓶；2—橡膠塞；3、6—穿刺鋼針；4—液體取樣口；5—氣體取樣口；7—橡膠軟管；8—洗氣瓶；9—集氣裝置

1.3 分析方法

1.3.1 產氣量

利用排水集氣法測量產氣量大小，即用量筒對排水集氣裝置中的排水體積進行測量，水體積即為產氣量大小。

1.3.2 化學需氧量(COD)

采用6B-200型COD速測儀測試產甲烷過程中發酵液的COD質量濃度。測試前對發酵液進行稀釋(發酵液∶蒸餾水=1∶20)。取7支帶有標號的潔凈消解管，分別對應不同取液階段的測試樣品(0.15 mL)，并依次向消解管內加入1 mL C1試劑(一種氧化劑)，5 mL C2試劑(濃硫酸)。將消解管依次放入6B-12型智能消解儀內消解10 min，消解完成后先在空氣中自然冷卻2 min，再向各消解管內分別加入3 mL蒸餾水，并再次在自來水中冷卻2 min。水冷結束后將消解管內各試液倒入特定比色皿中測試樣品的COD值。

1.3.3 輔酶F420活性

取不同階段發酵液各10 mL加入50 mL離心管中，并加入10 mL生理鹽水攪拌稀釋，在6 000 r/min條件下離心15 min。收集沉淀物，并再次加入15 mL生理鹽水，同時在95°C恒溫水浴鍋內水浴加熱30 min。冷卻至室溫后，向離心管內加入25 mL乙醇溶液，并再次在6 000 r/min條件下離心15 min。離心后取上部清液，并用4 mol/L氫氧化鈉溶液調節上部清液pH值至13.5，之后再在8 000 r/min條件下離心15 min，并將離心后的上部清液等體積分成2份。其中一份用6 mol/L的鹽酸溶液調節pH值略低于3.0，并記錄鹽酸使用量，另一份加入與鹽酸相同體積的蒸餾水作為參照對比樣。使用紫外可見分光光度計測試上述2份試液在波長420 nm處的吸光度值，并按照式(1)計算輔酶F420的活性。

式中：為輔酶F420濃度，μmol/L；為pH＜3的樣品溶液做參照，pH=13.5的試液在420 nm的吸光度值；為稀釋倍數(25倍)；為比色皿厚度(1.3 cm)；為F420在pH=13.5時的毫摩爾消光系數(54.3)。

1.3.4 其他指標

實驗組與對照組發酵液離心后取上部清液，并用蒸餾水稀釋10倍。使用UV-5200紫外可見分光光度計測試上部清液(稀釋后)在254 nm處吸光度值UV254，用來代替TOC(總有機碳)含量。采用FEI Quanta FEG 250場發射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察產氣前后煤表面變化特征。

2 結果與討論

2.1 產氣量

實驗組與對照組產氣量結果如圖2所示。由圖2可以發現，兩者產氣量均大致呈現先上升后下降的變化趨勢，且總產氣量分別是2 322.0 mL與1 330.2 mL。①實驗組在反應第1 天開始產氣(122.0 mL)，最大值出現在第3天(294.0 mL)，占總產氣量的12.66%。4 d之后產氣量開始逐漸下降，最終維持在67.67 mL。②對照組初始產氣時間晚于實驗組(第5天)，且出現兩個明顯的產氣峰值。這是因為白腐真菌能夠有效降解煤中的木質素[18-19]，繼而縮短了產甲烷過程的水解持續時間。11~16 d，產氣量由44 mL增加到294 mL。16 d之后產氣量開始下降，最終定格在32 mL，遠小于實驗組。

圖2 實驗組和對照組產氣量變化特征

2.2 化學需氧量COD與碳轉化率

煤是一種微溶于水的大分子有機混合物，外源菌的添加降解可使煤中脂肪烴、小分子芳香烴等可溶性有機質增加。發酵液中有機質含量越多，化學需氧量COD值越大。實驗組與對照組發酵液內COD值如圖3所示。實驗組與對照組COD分別為32.34~176.00 mg/L與576~609 mg/L，碳轉化率分別是5.10%與4.70%(表2)。這說明實驗組的降解轉化過程更為徹底，更多的有機質被轉化生成CH4、CO2等目標產物，而不是殘留在發酵液內。

產氣前由于未對白腐真菌做進一步分離處理，使得實驗組前3 d發酵液內有機質降解量大于生成量，COD值由65.02 mg/L降至32.34 mg/L (圖3)。隨后實驗組水解和產酸階段(3~9 d)生成的氨基酸類、酯類、酸醇類等小分子有機質使得COD值由32.34 mg/L增加到137.13 mg/L。12~21 d，產甲烷菌利用乙酸、甲基類等有機質生成CH4與CO2，同時酸毒性有機質開始逐步積累，使得COD值(71.412—176.00—66.32—97.47 mg/L)呈先增加后降低再增加的浮動特征。對照組COD值變化與實驗組基本相似，但拐點出現時間略有差異，這與兩者反應體系內微生物多樣性和菌群間競爭強度密切相關。

圖3 實驗組與對照組化學需氧量COD

表2 產氣前后碳含量變化

2.3 輔酶F420活性

研究證實，單位比色皿在254 nm波長光程下紫外線吸收度UV254與TOC相關度高，可以作為總有機碳含量TOC的一種很好的替代參數[20]。煤厭氧發酵產甲烷是一系列生物化學的偶聯反應，產甲烷菌位于整條厭氧生物鏈最頂端，而輔酶F420作為一種產甲烷菌所特有的酶類，與產甲烷菌的活性有著不可分割的聯系，是產甲烷菌活性狀態的反應指標之一[21-22]。因此，采用紫外分光光度法測試，反映試液內底物變化情況及產甲烷活性狀態的UV254大小和輔酶F420活性，測試結果如圖4所示。

圖4 輔酶F420與UV254變化

一般來說，產酸細菌生長速率較快，世代時間(微生物每繁殖一代所需要的時間)為10~30 min，而產甲烷菌生長非常緩慢，其世代時間一般在4~6 d[23]。實驗組煤樣經預處理后，其孔隙連通性增強，孔徑增大，為微生物提供了更多的吸附位和降解點[24-25]。從開始接種到培養第3天，產甲烷菌的世代時間還未完成，數量較少，但產酸細菌的世代時間早已完成，數量較多，并對煤進行了部分降解，使發酵液內生成了乙酸、丙酸、丁酸等酸性有機物。但丙酸、丁酸等酸性有機物無法被產甲烷菌直接利用，導致發酵液內總有機碳的生成速率高于降解速率。因此，實驗組UV254值升至0.026 43 cm，輔酶F420活性降至0.005 03 μmol/L(圖4a)。隨著產甲烷菌世代時間的完成，輔酶F420活性增長迅速，在第6天時達到最大活性值0.011 72 μmol/L，同時有機碳開始被大量消耗，在第6天時含量出現最低值，UV254為0.021 81 cm。之后產甲烷菌的活性由于酸性有機物的過度積累而受到抑制，由最大值降至最小值(0.003 65 μmol/L)，有機碳含量開始逐步增加，UV254最終維持在0.03 cm附近。

在反應前6 d，對照組發酵液內用于滿足菌體繁殖代謝及細胞活動所需能量的有機碳源酵母膏優先被消耗，致使發酵液內有機碳不斷減少，UV254降低至0.008 09 cm(圖4b)，而產酸細菌與產甲烷菌在生長速率的差異性，使發酵細菌、產氫產乙酸菌產生的酸抑制了輔酶F420活性[26-27]，導致其在第3~6天增長較為緩慢。之后水解和產酸階段生成的酸性物質與煤中碳源被其有效利用，輔酶F420活性增長迅速，在第9天時達到最大活性值0.007 97 μmol/L，而細菌代謝所生成的大量含碳有機物也直接導致了接種液內有機碳的快速增加。9~18 d，有效碳源的減少影響并降低了輔酶F420的活性，使其降低至最小值0.003 47 μmol/L。18 d之后，對照組與實驗組中，輔酶F420活性的增加可能與產甲烷菌群的遷移和本身生理狀態的調整、煤孔隙結構的變化相關，仍需進一步研究證實。

2.4 SEM分析

實驗組與對照組產氣前后掃描電鏡圖片如圖5所示。

圖5 實驗組與對照組產氣前后煤顯微結構變化特征

由圖5可以發現，實驗組在產氣前(預處理結束后)煤表面更加粗糙，且表面微生物吸附量也更多，這為其后續產甲烷過程中水解期的縮短與總產氣量的增加提供了必要的物質基礎。產氣結束后煤表面更加粗糙，且有菌簇的形成。與實驗組相比，產氣前對照組煤表面相對光滑，且微生物吸附量也較少。產氣結束后，對照組煤表面同樣變得較為粗糙，但粗糙度小于實驗組。圖5表明煤樣在產氣前后均發生了不同程度的降解，并伴有菌群的遷移和吸附，且白腐真菌預處理能夠明顯改善和提高煤中有機質的有效降解。這與實驗組具有高產氣量、高碳轉化率、高輔酶活性的“三高”特征具有很好的吻合性。

3 結論

a.煤樣經白腐真菌預處理后初始產氣時間明顯提前，較對照組提前4 d，總產氣量和碳轉化率也明顯增加。

b. 實驗組降解更為徹底，實驗組和對照組化學需氧量COD分別是32~176 mg/L與576~609 mg/L。

c.輔酶F420活性受TOC含量和產酸細菌的影響，且實驗組輔酶活性更高，降解過程也更為徹底。

d.白腐真菌預處理為微生物在煤表面提高了更多的吸附位點，煤表面更加粗糙，且產氣結束后有菌簇的形成。

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Effect of white rot fungi pretreatment on methane production from anaerobic fermentation of coal

ZHANG Huaiwen, HUANG Song, YAN Xiatong, ZHAO Shufeng, ZHANG Minglu, XIA Daping

(School of Energy Science and Engineering, Henan Polytechnic University, Jiaozuo 454000, China)

To investigate the effect of white rot fungi pretreatment on methane production from anaerobic fermentation of coal, fermentation experiments of biogas production were conducted using long flame coal. The coal samples pretreated with white rot fungi were the experimental group(EG), and original untreated coal samples were the control group(CG). The COD(chemical oxygen demand) mass concentration, activity of coenzyme F420, and changes of coal morphology were measured using potassium dichromate method, ultraviolet spectrophotometry, and SEM, respectively. The results showed the following: The total gas production and conversion rate in the EG and CG were 2 322.00 mL and 5.10%, 1 330.20 mL and 4.70%, respectively. Moreover, the hydrolysis stage in the EG was significantly shorter than that in the CG. The COD value in the EG and CG was 32-176 mg/L and 576- 609 mg/aL, respectively, and the degradation of EG was more thorough. The maximum value of coenzyme F420in the EG and CG was 0.011 72 μmol/L and 0.007 97 μmol/L, respectively, and its activity was effected by TOC(total organic carbon) content and acid-producing bacteria. At the end of pretreatment and gas produciton, the roughness of the coal surface in the EG was stronger, the adsorption sites and adsorption capacity of microorganisms were also more high, and accompanied by the generation of bacterioflora. This test research demonstrates the advantages and adaptability of biological pretreatment with white rot fungi, which is beneficial to the industrialization utilization of biogas resources in coal.

long flame coal; biological pretreatment; white rot fungi; anaerobic fermentation; methane; Qianqiu coal mine of Yima in Henan

P618.11

A

10.3969/j.issn.1001-1986.2020.02.019

1001-1986(2020)02-0120-06

2019-10-11；

2019-12-11

河南省科技攻關項目(182102310845)

Science and Technology Key Project of Henan Province(182102310845)

張懷文，1992年生，男，山西晉中人，碩士研究生，研究方向為煤層生物氣能源開發. E-mail：1136636126@qq.com

夏大平，1983年生，女，安徽潁上人，博士，副教授，從事煤層氣地質與勘探開發研究工作. E-mail：xiadp22@hpu.edu.cn

張懷文，黃松，閆夏彤，等. 白腐真菌預處理對煤厭氧發酵產甲烷的影響[J]. 煤田地質與勘探，2020，48(2)：120–125.

ZHANG Huaiwen，HUANG Song，YAN Xiatong，et al. Effect of white rot fungi pretreatment on methane production from anaerobic fermentation of coal[J]. Coal Geology & Exploration，2020，48(2)：120–125.

(責任編輯 范章群)