寬體金線蛭殺鮭氣單胞菌的藥物敏感性試驗

唐 毅 袁 淵 王 偉 劉 煬 李 紅

(1.西南大學動物科技學院動物科學國家級實驗教學示范中心，重慶 北碚 400715；2.重慶多普泰制藥股份有限公司，重慶 萬盛 400800；3.重慶市永川區秀宏水蛭養殖中心，重慶 永川 402160)

隨著國內外制藥公司以及臨床醫學等方面對寬體金線蛭需求的增加，其市場價格居高不下，在此背景下其人工養殖在國內一些地方迅速興起，養殖的規模和集約化程度也逐年提高。但與此同時，多種疾病尤其是細菌性疾病的發生對寬體金線蛭的人工養殖產生了較大影響。本試驗采用12種常用漁藥對從寬體金線蛭患病個體病灶分離鑒定的致病菌——殺鮭氣單胞菌進行藥敏試驗，測定其體外抑菌效果，旨在為因殺鮭氣單胞菌感染而導致的寬體金線蛭細菌性疾病的有效防治提供一定的科學依據。

一、材料和方法

1.試驗菌

試驗菌為殺鮭氣單胞菌，來自西南大學動物科技學院水產養殖技術與工程實驗室，從患類似魚類癤瘡病的寬體金線蛭病灶組織中分離、鑒定。

2.試驗藥品

高錳酸鉀(99.5%，紅褐色粉末，成都市科龍化工試劑廠生產)；二氧化氯(45%亞氯酸鈉，穩定性白色粉末，山西半月動物藥業有限公司生產)；三氯異氰尿酸(50.0%，白色粉末，成都民生消毒劑有限責任公司生產)；苯扎溴銨(2.5%，透明膠狀溶液，德州億申康消毒制品有限公司生產)；戊二醛(25%，透明膠狀溶液，成都市科龍化工試劑廠生產)；聚維酮碘(5%碘，紅棕色液體，四川恒通動物制藥有限公司生產)；福爾馬林(40%甲醛，透明膠狀溶液，成都市科龍化工試劑廠生產)；氟苯尼考(99.5%氟甲砜霉素，白色粉末，成都興旺動物藥業有限公司提供)；恩諾沙星(99.5%，白色粉末，廣州市金谷農業科技有限公司提供)；硫酸新霉素(6.5%，白色至淡黃色粉末，四川恒通動物制藥有限公司生產)；硫酸慶大霉素(2%，無色澄明溶液，四川省川龍動科藥業有限公司生產)；鹽酸多西環素(10%，淡黃色或黃色可溶性粉末，重慶方通動物藥業有限公司生產)。

3.培養基的制備

營養瓊脂培養基平板：將純水1000毫升、牛肉浸膏5.0克、蛋白胨10.0克、氯化鈉5.0克、磷酸氫二鉀1克、20%瓊脂放入三角瓶中加熱攪拌直至溶解，調節pH 7.2～7.4，15磅高壓蒸汽滅菌30分鐘后倒平板(直徑90毫米培養皿)，靜置冷卻后放入4℃冰箱備用。

4.藥物敏感試驗

(1)藥敏片的制備。取新華1號定性濾紙，用打孔機打成直徑6.0毫米的圓形紙片。取洗凈烘干的青霉素瓶14只，每只瓶中放入20片圓形紙片，用單層牛皮紙包扎密封瓶口，121℃高壓滅菌20分鐘后置烘箱中烘干，待其完全干燥后往盛有紙片的青霉素瓶中加入200微升稀釋成一定濃度的藥液，并用滅菌后的鑷子翻動濾紙片，使藥液充分浸入每一紙片，同時在青霉素瓶一側貼上標簽，記錄試驗藥品名稱，放37℃烘箱中過夜干燥，之后密蓋置于陰暗干燥處保存(有效期3～6個月)。

(2)K-B紙片擴散法藥敏試驗。在無菌條件下，取殺鮭氣單胞菌菌懸液(麥氏標準比濁法調整菌液濃度為0.5麥氏標準：1.5×108CFU/毫升)350微升，滴加入普通營養瓊脂平板并將其涂布均勻，用無菌鑷子取藥敏片貼于平板培養基表面，28℃恒溫培養24小時，觀察并測量抑菌圈直徑。根據抑菌圈大小判斷藥物對殺鮭氣單胞菌的抑菌效果。抑菌圈直徑≥20毫米判斷為敏感(S)，10～20毫米判斷為中介(I)，＜10毫米判斷為耐藥(R)。

5.最小抑菌濃度(MIC)的測定

試管二倍稀釋法測定藥物的MIC。取12支滅菌的小試管，向1號管加入配制好的藥液1毫升，從中吸取0.5毫升到2號管，以此類推至第10號管后棄0.5毫升。然后向1～10號管中各加入4毫升相應液體培養基和0.5毫升菌懸液(1.5×108CFU/毫升)并混勻。設陽性對照(4毫升培養基＋0.5毫升細菌液＋0.5毫升無菌生理鹽)和陰性對照(4毫升培養基＋0.5毫升藥液＋0.5毫升無菌生理鹽)各1個。將試管置于28℃震蕩培養箱中培養24后觀察結果，試管中液體清澈透明即為無菌生長，以無菌生長試管中的最低藥物濃度為MIC。

6.最小殺菌濃度(MBC)的測定

從每一支MIC試驗管中吸取0.1毫升均勻涂布于平板上，28℃恒溫培養24小時觀察平板上菌落生長情況，以菌落數小于5個的最小稀釋度的藥物濃度為MBC。

二、結果與分析

1.常用漁藥的抑菌效果

24小時藥敏試驗結果顯示，殺鮭氣單胞菌對高錳酸鉀、苯扎溴銨、戊二醛等5種藥物表現為耐藥性，對二氧化氯和甲醛為中介，對氟苯尼考、恩諾沙星、新霉素等5種藥物敏感。進一步藥敏試驗至36小時和48小時，顯示二氧化氯和甲醛的抑菌圈在逐漸變小，表明藥物的抑菌效果(藥效)在試驗期內逐漸減弱；氟苯尼考的抑菌圈不斷變大，表明其抑菌效果(藥效)在試驗期內既逐漸增強，也顯示其抑菌的持續性較好；恩諾沙星、新霉素、慶大霉素和多西環素4種藥物的抑菌圈變化不明顯，表明其抑菌的持續性較好，具體見表1和圖1～圖4。

2.MIC與MBC試驗

從K－B紙片瓊脂擴散法藥敏試驗結果中，篩選出兩種抑菌效果相對更優的藥物——氟苯尼考和恩諾沙星，采用試管二倍稀釋法進行MIC和MBC測定，結果顯示氟苯尼考和恩諾沙星對殺鮭氣單胞菌的MIC分別為7.5、1.563微克/毫升，MBC分別為7.5、1.563微克/毫升，見表2、表3。

三、討論

1.常用漁藥對殺鮭氣單胞菌的敏感性

高錳酸鉀、二氧化氯、苯扎溴銨、戊二醛、甲醛、三氯異氰尿酸和聚維酮碘7種漁藥為水產上常用的化學消毒劑或殺菌劑，通常用于養殖水體或養殖對象的消毒等，這7種藥物應對殺鮭氣單胞菌顯示一定的抑菌、殺菌效果。本試驗結果表明，殺鮭氣單胞菌對高錳酸鉀、苯扎溴銨、戊二醛、三氯異氰尿酸和聚維酮碘5種消毒劑都表現出耐藥現象，對二氧化氯和甲醛為中介，這可能與這些漁藥的基本性質有關。高錳酸鉀、二氧化氯、聚維酮碘等在較高溫度下(制作藥敏紙片曾經過烘箱烘干過程)可能易于揮發或分解，無法保持有效的抑菌濃度，從而對體外抑菌試驗結果造成較大影響。此外，消毒劑配制的濃度偏低有可能被細菌分解而失效，所配藥液的酸堿性不適宜(如戊二醛在酸性條件下其抑菌效果差或無明顯效果)等，也可能對藥敏試驗結果帶來一定影響。

表1 12種常用漁藥對殺鮭氣單胞菌48小時體外抑菌試驗結果

本研究中，殺鮭氣單胞菌對氟苯尼考、恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、多西環素5種抗菌藥物高度敏感，因而表現出良好的抑制效果。另據有關資料報道，氟苯尼考、恩諾沙星、新霉素、慶大霉素對有關魚類病害的致病菌殺鮭氣單胞菌具有顯著的抑菌效果，可見本研究結果與之基本一致，生產中可重點選用，尤其是氟苯尼考和恩諾沙星可作為首選藥物。

從表1還可看出，二氧化氯和甲醛的抑菌圈直徑在24～48小時內有逐漸變小的趨勢，而氟苯尼考的抑菌圈則不斷變大，恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、多西環素的抑菌圈變化并不明顯。由此表明，二氧化氯和福爾馬林抑菌的穩定性不高，表現出抑菌的延續性較差。相反，氟苯尼考、恩諾沙星等抑菌的穩定性較高，抑菌的延續性較好。

2.敏感藥物對致病菌的MIC與MBC

由表2、表3可知，氟苯尼考對殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC均為7.5微克/毫升，恩諾沙星的MIC和MBC均為1.563微克/毫升。王高學等研究了氟苯尼考等24種抗菌藥物對殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC，結果表明，氟苯尼考對殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC均為3.125微克/毫升，恩諾沙星的MIC和MBC均為0.195微克/毫升；周紅霞等報道了氟苯尼考對殺鮭氣單胞菌的MIC為8微克/毫升，恩諾沙星的MIC為0.5微克/毫升。由此可見，這些報道的結果與本試驗測得的結果具有相似性，但在具體數據上存在一定差異。其原因可能與藥物產地及其配制濃度、菌株類型與菌懸液濃度及其生理活性、培養基組成等諸多因素不同或存在差異而影響藥物的抗菌力強弱有關。

圖1 新霉素對殺鮭氣單胞菌抑菌效果

圖2 慶大霉素對殺鮭氣單胞菌抑菌效果

圖3 恩諾沙星對殺鮭氣單胞菌抑菌效果

圖4 多西環素藥物對殺鮭氣單胞菌抑菌效果

表2 氟苯尼考對殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC

表3 恩諾沙星對殺鮭氣單胞菌的MIC和MBC