不同白蠟品種的DNA指紋圖譜特征研究

李斌 史開奇

摘 要：通過構建DNA指紋圖譜，從DNA分子水平鑒定區分大葉白蠟（對照）、大葉白蠟伊犁1號、金葉白蠟，為探究構建白蠟種質資源的方法提供了堅實的理論依據。利用來自白蠟的11對SSR多態性引物對2個普通白蠟品種進行了PCR擴增及非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，并構建白蠟DNA指紋圖譜，將11份白蠟種質完全區分。這些SSR標記所構建的白蠟的指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受外部環境影響，不僅可用于白蠟品種的鑒定，還可為白蠟品種的雜合性鑒定提供可靠的技術，為白蠟良種審認定、分子標記輔助育種等方面奠定理論基礎。

關鍵詞：白蠟;SSR標記;指紋圖譜

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530019

白蠟樹是我國分布廣泛的一種常見耐鹽堿的綠化樹種[1]。白蠟（Fraxinus sp.）屬雙子葉植物綱，木犀科（Oleceae），是木犀亞科（Oleoideae）植物的通稱，又稱梣（chén）。白蠟喜光，稍耐蔭，喜溫暖濕潤氣候，頗耐寒，喜濕，耐澇干旱。堿性、中性、酸性土壤上均能生長，抗煙塵，對二氧化硫、氯、氟化氫有較強抗性;萌芽、萌蘗力較強，耐修剪，生長較快，壽命較長[2，3]。白蠟種質資源種類眾多，品種的鑒定研究具有深遠意義。前人研究表明由于微衛星標記技術SSR（Simple Sequence Repeat） 的不斷發展和完善，為種質資源的純度及品種真實性鑒定提供理論依據[5]。

本試驗通過11對SSR引物對11個不同的品種進行遺傳多樣性的分析研究，擬通過DNA指紋圖譜，從DNA水平鑒定新疆地區各個白蠟的品種。由于白蠟樹種擁有較高的生態經濟價值和發展潛力，因此綜合白蠟樹種資源目前的利用狀況，其還有很大的研究空間。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為分布于新疆不同生態區域內的11個白蠟材料。

1.2 DNA提取

提取白蠟基因組DNA利用CTAB法[6]。具體操作步驟如下。

取幼嫩真葉材料1小片，用蒸餾水沖洗干凈，置1.5mL的離心管中，加液氮，快速冷卻;將材料快速研磨成粉末，然后加入65℃預熱的CTAB提取緩沖液700μL;放入65℃水浴30～40min，每10min輕輕地振蕩1次;加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）700μL，混勻5min，12000rpm離心5min;取上清液轉入另一1.5mL新離心管中，加入欲冷的無水乙醇800μL，放置于4℃10min左右，讓DNA充分沉淀;小心清除無水乙醇、加入欲冷70%乙醇漂洗2次;室溫晾干，輕輕彈離心管，至沒有水滴即可;將DNA溶于50μL或100μL的0.1倍TE中，加入RNase（10mg/mL）1μL于37℃消化15～30min;于-20℃或4℃保存。

1.3 SSR標記引物序列的獲得及合成

通過引物篩選，將多態性豐富且穩定性好的SSR引物用于白蠟品種的鑒定及遺傳多樣性分析。具體篩選的引物組合如表1所示。

1.4 SSR反應體系

SSR標記技術反應體系如表2所示。

上述反應物混勻后于PCR儀（PTC-200TM Peltiter thermal cycler）上擴增。

程序如下：94℃5min;94℃30s;60℃45s;72℃1min;循環35次;72℃10min;10℃進行保存。

1.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測SSR擴增產物，PCR產物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。6%聚丙烯酰胺凝膠配方：6mL聚丙烯酰胺膠母液;2mL10×TBE;10mL超純水;200μL10%過硫酸胺;20μL TEMED混合。

1.6 銀染程序

1.6.1 固定

將玻璃板從電泳槽取下，拔出梳子，并輕輕取下長板，膠面朝上放入盛有2000mL固定液的塑料盒中。

1.6.2 染色

倒入2000mL染色液，染色7min后，用蒸餾水漂洗30s。

1.6.3 顯色

倒入2000mL顯色液，在搖床上輕搖至條帶清晰地顯出，顯色液倒去。

1.6.4 漂洗及保存

倒入2000mL蒸餾水漂洗約30s。取出后自然晾干，掃描或照相保存。

1.6.5 溶液配置

2000mL固定液配置：1100mL蒸餾水加200mL無水乙醇加10mL乙酸）;

2000mL染色液配置：2000mL蒸餾水加3g AgNO3;

2000mL顯色液：2000mL蒸餾水加30g NaOH加4mL CH2O。

1.7 譜帶記錄及數據分析

1.7.1 反應條帶觀察及統計

凝膠干燥后，形成DNA多態性圖譜，對膠片上的SSR條帶進行量化處理，并以0、1方式記錄。將圖譜上有清晰的條帶記“1”，同一位置沒有條帶記“0”，生成“1”和“0”組成的原始矩陣。

1.7.2 數據分析

SSR轉化成1、0數據后，利用NTSYS-2.10e軟件中的SIMQUAL程序求Dice相似系數矩陣，用SHAN程序中的UPGMA方法進行聚類分析，并通過Tree plot模塊生成聚類圖。

2 結果與分析

2.1 品種鑒定

從11對引物中篩選出4對多態性較好的SSR引物，分別對大葉白蠟（對照）、大葉白蠟伊犁1號和金葉白蠟進行鑒定區分。結果表明：引物Y112-F、Y082、Y124能夠分別擴增出區分大葉白蠟（對照）和大葉白蠟伊犁1號特異條帶;引物Y120、Y082能夠分別擴增出區分大葉白蠟（對照）和金葉白蠟特異條帶。電泳結果如圖1所示。

2.2 遺傳多樣性分析

采用4對SSR引物對11個白蠟材料進行鑒定，聚類結果見圖2。由表2可知，大葉白蠟伊犁1號和金葉白蠟與大葉白蠟（對照）遺傳距離較大。

3 結語

通過建立SSR分子標記體系及指紋圖譜，結果表明：引物Y112-F、Y082、Y124能夠較好地區分大葉白蠟（對照）和大葉白蠟伊犁1號;引物Y120、Y082能夠較好地區分大葉白蠟（對照）和金葉白蠟。SSR標記所構建的大葉白蠟指紋圖譜，不受表型特征限制，也不受環境影響，可用于大葉白蠟品種的區分和鑒定。

參考文獻

[1] 李慶國，劉翠蘭，姚俊修，王因花，王開芳，任飛，燕麗萍，吳德軍.我國中低緯度地區白蠟DNA圖譜構建及SSR標記遺傳多樣性分析[J].山東農業科學，2018，50（08）：19-23.

[2]陳宇，郭宇蘭.大葉白蠟引種栽培試驗初步研究[J].中國林副特產，2019（03）：25-26，30.

[3]燕麗萍，吳德軍，毛秀紅，姚俊修，任飛，李善文，王開芳，王因花，劉翠蘭.基于SSR熒光標記的白蠟核心種質構建[J].中南林業科技大學學報，2019，39（07）：1-9.

（責任編輯 周康）