油菜細胞質雄性不育系1193A恢復基因SNP位點的TSP分析

胡燕 尹明智 冶飛碟

摘 要：油菜細胞質雄性不育雜種是當前油菜雜種優勢利用的主要途徑，而恢復基因的連鎖標記研究對于恢復系的選育和改良至關重要。本研究基于前期研究結果設計引物對與油菜細胞質雄性不育系1193A恢復基因連鎖的2個SNP位點進行TSP標記分析，以期建立一種簡單高效易行的油菜雄性不育系1193A恢復基因的SNP分析方法。結果表明，設計的2對TSP標記引物擴增效果較好，可用來進行后續的研究分析。

關鍵詞：油菜;不育系;恢復基因;SNP;TSP

中圖分類號：S-3 ? ? ? 文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200530007

油菜是我國主要的油料作物之一，具有明顯的雜種優勢，油菜細胞質雄性不育系統（Cytoplasmic Male Sterility，CMS）是當前油菜雜種優勢利用的主要途徑，也是最重要的傳粉控制系統之一。油菜CMS系統一般包含不育系、保持系和恢復系，而不育系的應用需選育強優勢恢復系用來配制強優勢雜交種，這對油菜雜種優勢的利用是至關重要的[1]。常規的育種方式需大量雜交，育種周期長，工作量大。隨著測序技術以及生物技術的發展，分子育種手段也隨之發展，其中分子標記技術在分子育種中應用最為廣泛。分子標記方法不受外界環境因素的影響，對基因定位及分子育種有重要作用。SNP（Single Nucleotide Polymorphism，單核苷酸多態性）作為第3代分子標記，目前已廣泛應用于遺傳分析，是一種便于分析，遺傳穩定性強的分子標記[2]。SNP的檢測方法眾多，但有些技術方法較難掌握，且應用成本較大。TSP（Temperature Switch PCR）方法，是由Tabone等[3]提出，優點是只需經過一輪PCR，就可以直接通過瓊脂糖凝膠電泳檢測SNP位點，方法簡便易行。目前TSP方法在大麥[4]、小麥[5]、葡萄[6]等物種的SNP位點檢測分析中都有了成功的應用。

前期研究中通過屬間雜交獲得了油菜新型胞質雄性不育系1193A[7]，并通過大量的測交發現了其恢復系。通過油菜60K SNP芯片，結合BSA法將恢復基因初步定位在C09染色體上，并發現了2個連鎖的SNP位點[8]，本研究將對這2個SNP位點進行TSP標記分析，以期建立一種簡單高效易行的油菜雄性不育系1193A恢復基因的SNP分析方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

不育系1193A與恢復系1193R2的種子均由國家油料改良中心湖南分中心提供。

1.2 油菜基因組DNA的提取

利用CTAB法提取基因組總DNA。

1.3 TSP標記檢測SNP位點

根據前期油菜60K SNP芯片分析的研究結果[8]，本研究對Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830 2個SNP位點進行TSP標記的引物設計，其引物設計原則參照Tabone等提出的原則進行設計[3]。設計2個位點特異性引物和1個等位基因特異性引物，其中，位點特異性引物是在SNP位點的兩側，引物退火溫度為63℃，等位基因特異性引物在SNP位點上游，退火溫度為45℃，然后在5′端人工添加2～3bp的核苷酸序列[6]。

PCR反應體系為20μL，其中包括：ddH2O 10.6μL，10×緩沖液2μL，每個引物0.2μmol/L，dNTPs 0.2μmol/L，Taq酶1U，DNA 50ng。PCR擴增程序為：95℃預變性5min;先94℃40s，60℃40s，72℃40s，15個循環;然后94℃10s，45℃30s，5個循環;最后94℃40s，54℃40s，72℃10s，15個循環。采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。

2 結果與分析

2.1 SNP位點及引物設計

針對SNP標記分析時TSP方法設計引物的要求，對前期研究開發的位于C09染色體上的，與恢復基因連鎖的SNP位點Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044和Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830進行了分析，并設計TSP標記引物用于后續的檢測分析。

2.2 SNP位點TSP標記分析結果

用3對TSP標記引物對2個SNP位點進行PCR擴增檢測，結果顯示：有2對TSP標記引物能擴增出與預期長度相吻合的PCR產物，電泳條帶較清晰。如圖1所示，利用引物TSP1和TSP2對候選SNP位點A/G進行TSP標記分型，從電泳條帶可得出，引物TSP1檢測不育系1193A在720bp和380bp左右各有1條帶，引物TSP2檢測不育系1193A在720bp和200bp左右各有1條帶，而恢復系1193R2均是在720bp左右的1條帶，說明通過TSP1和TSP2標記能夠檢測Bn-scaff_ 17487_ 1-p1890044所在的SNP位點差異。而設計的TSP3標記引物對Bn-scaff_ 22835_ 1-p525830處的SNP位點進行檢測沒有獲得預期的結果，可能是引物設計不合理，或PCR條件不佳造成的。

3 討論

油菜CMS系統有同源胞質不育系和異源胞質不育系。不育系1193A為屬間雜交后代選育而來的異源胞質不育系，而這種不育系往往存在恢復源較窄的問題。為了有利于發現更多的恢復源材料，選育出恢復系，人們常常會將不育系與大量的材料進行廣泛雜交，再觀察雜交后代的育性表現，但這樣工作量大，時間較長。分子標記輔助育種技術能縮短育種周期，近幾年在作物品種育種中發揮了重要作用，日漸受到育種家的喜愛。對恢復系進行分子標記研究，找到與恢復基因緊密連鎖的標記，可為恢復系的選育提供技術支撐，提高選擇效率和準確性。TSP標記引物檢測方便，成本較低，結果的可靠度也較高，只需進行一輪PCR即可直接從電泳結果分析SNP位點，是AS-PCR的升級版[9]，適用于一般實驗室開展SNP檢測。本研究設計了TSP標記引物3對，用于檢測不育系1193A恢復基因的SNP位點差異，結果表明，其中2對擴增效果較好，可用來進行后續的研究分析。這為通過簡單易行的方式選育恢復源材料提供了技術支撐。

參考文獻

[1] 程計華，李云昌，梅德圣，等.幾種農作物細胞質雄性不育恢復基因的定位和分子標記研究進展[J].植物學通報，2006，23（6）：613-624.

[2]Kim S，Misra A. SNP genotyping：Technologies and biomedical applications[J]. Annual Review of Biomedical Engineering，2007（9）：289-320.

[3] Tabone T，Mather D，Hayden M. Temperature Switch PCR（TSP）：Robust assay design for reliable amplification and genotyping of SNPs[J]. BMC Genomics，2009，10 （1）：580.

[4] Hayden M J，Tabone T，Mather D E.Development and assessment of simple PCR markers for SNP genotyping in barley[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119 （5）：939-951.

[5] Huang X Q，Brlé-Babel A. Sequence diversity，haplotype analysis，association mapping and functional marker development in the waxy and starch synthase IIa genes for grain-yield-related traits in hexaploid wheat（Triticum aestivum L.）[J]. Mol Breeding，2012（30）：627-645.

[6]郭大龍，李猛，張國海，等.葡萄SNP標記的CAPS和TSP分析[J].園藝學報，2013，40（11）：2307-2315.

[7]尹明智，官春云.甘藍型油菜細胞質雄性不育系1193A的選育及分析[J].西南農業學報，2017，30（9）：1947-1953.

[8]尹明智.野油胞質雄性不育系1193A的研究[D].長沙：湖南農業大學，2014.

[9]雷天剛，何永睿，彭愛紅，等.柑橘CAPS標記和AS-PCR引物的開發[J].園藝學報，2012，39（6）：1027-1034.

（責任編輯 賈燦）