生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響

阿爾祖古麗·阿卜杜外力　玉素甫·蘇來曼　巴吐爾·阿不力克木

摘 要：研究生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響。采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳技術對鮮羊腿（0 d）、腌制3 d以及對照組、生姜蛋白酶添加量0.05%組（S組）、獼猴桃蛋白酶添加量0.05%組（M組）風干前期（8 d）、風干中期（15 d）、風干后期（23 d）、成熟期（30 d）工藝點的干腌羊火腿微生物菌相變化進行測定。結果表明：腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、表皮巨球菌（Macrococcus epidermidis）、土壤葡萄球菌（S. edaphicus）、哈夫尼亞菌（Hafnia paralvei）、明串珠菌（Leuconostoc gelidum）是各組干腌羊火腿的優勢菌，其中葡萄球菌屬種類較多;2 種蛋白酶可豐富干腌羊火腿微生物的種類;生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶處理組成熟30 d時均出現木糖葡萄球菌（S. xylosus）;在整個加工過程中，干腌羊火腿微生物菌相變化較穩定，受2 種蛋白酶的影響不大。

關鍵詞：干腌羊火腿;生姜蛋白酶;獼猴桃蛋白酶;聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳;菌相變化

Effect of Zingibain and Actinidin on Microfloral Changes during Processing and Ripening of Dry-Cured Mutton Ham

Aerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU*

（College of Food Science and Pharmacy， Xinjiang Agricultural University， ?rümqi 830052， China）

Abstract： This work studied the effects of zingibain and actinidin on microfloral changes during the processing and ripening of dry-cured mutton ham. Fresh and three-day salted Biceps femoris muscles as well as samples from the control， 0.05% zingibain and 0.05% actinidin addition groups taken at the early （day 8）， middle （day 15） and later stages （day 23） of air drying and on day 30 of ripening were used as experimental objects. Polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis （PCR-DGGE） was used to analyzed the microflora. Results showed that Staphylococcus saprophyticus， Macrococcus epidermidis， S. edaphicus， Hafnia paralvei， and Leuconostoc gelidum were the dominant bacteria in all samples. Staphylococcus was the most diverse genus. The two proteases could enrich the microbial species in dry-cured mutton ham. Staphylococcus xylosus appeared on day 30 of maturation for the treatment groups. During the entire process， the microflora remained relatively stable and was little affected by the two proteases.

Keywords： dry-cured mutton ham; zingibain; actinidin; polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis; microfloral change

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010

中圖分類號：TS251.53 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0008-05

引文格式：

阿爾祖古麗·阿卜杜外力， 玉素甫·蘇來曼， 巴吐爾·阿不力克木. 生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿微生物菌相變化的影響[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010. ? ?http：//www.rlyj.net.cnAerzuguli·ABUDUWAILI， Yusufu·SULAIMAN， Batuer·ABULIKEMU. Effect of zingibain and actinidin on microfloral changes during processing and ripening of dry-cured mutton ham[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 8-12. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-010. ? ?http：//www.rlyj.net.cn變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術是1979年由Fischer[1]、Lerman[2]等提出的一種分離微生物的凝膠電泳技術[3-4]。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術是在傳統微生物技術基礎上擴增rDNA或rRNA，從而用于分子鑒定，并在微生物多樣性研究方面得到良好應用的一種技術[5-6]。PCR-DGGE技術的原理是從樣品中直接提取細菌總DNA，進行PCR擴增，并將DNA分子雙螺旋結構通過梯度分布的不同質量濃度聚丙烯酰胺凝膠進行解鏈，隨解鏈程度的增加，其遷移率逐漸減小，從而將DNA（長度相同但堿基序列不同）分離[7]。相對于傳統微生物分離鑒定方法，PCR-DGGE技術具有經濟快速、可靠性強、重現性好、方便快捷等優點[8]。

PCR-DGGE技術在肉制品中主要用于研究新疆熏馬腸[9]、風干羊肉[10]、熱鮮肉[11]、冷鮮羊肉[12]、氣調包裝切片熟肉制品[13]、真空包裝牛肉[14]、冷卻牛肉[15]、低溫貯藏豬肉[16]、真空包裝煙熏火腿切片[17]、魚類[18]、冰鮮雞[19]、鹽水鵝[20]等的微生物菌相變化。

本研究采用PCR-DGGE技術研究生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶對干腌羊火腿菌相變化的影響，為外源植物蛋白酶在干腌羊火腿中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆綿羊鮮后腿 烏魯木齊沙依巴克區和田街農貿市場牛羊肉配送中心。

生姜蛋白酶（酶活力≥800 U/mg）、獼猴桃蛋白酶（酶活力≥500 U/mg） 上海鼓臣生物技術有限公司;

細菌基因組DNA提取試劑盒、Go Taq Green Master Mix、Tris-堿、丙烯酰胺、過硫酸銨、N，N-甲叉雙丙烯酰胺、去離子甲酰胺、瓊脂糖、尿素、四甲基乙二胺、Na2EDTA·2H2O 天根生化科技公司;Marker 東勝生物科技有限公司;乙醇（體積分數75%、95%）、硝酸銀、冰乙酸、無水碳酸鈉、氫氧化鈉、甲醛 康濟藥械有限公司。

1.2 儀器與設備

DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱、DK-8D電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司;Avanti-J-26S XPI落地式高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter有限公司;

SWC7-1F超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;INGENYphorU-2 DGGE電泳儀、C1000 PCR擴增儀?美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 干腌羊火腿加工工藝

工藝流程：新鮮羊后腿→冷卻修整→低溫腌制→浸泡洗腿→吊掛風干→成熟→成品

工藝條件：參考阿爾祖古麗·阿卜杜外力等[21]的方法。

1.3.2 取樣

以羊腿股二頭肌為采樣點，分別設置生姜蛋白酶添加量0.05%（占原料肉的質量分數，下同）處理組（S組）、獼猴桃蛋白酶添加量0.05%處理組（M組）和對照組，分別于風干前期（8 d）、風干中期（15 d）、風干后期（23 d）、成熟期（30 d）工藝點及鮮羊腿（0 d）、腌制（3 d）階段取樣，置于-20 ℃冷凍保藏，用于微生物菌相測定。蛋白酶均為腌制（3 d）結束后添加。

1.3.3 細菌總DNA提取

參考Golowczyc等[22]的方法，并稍作修改。在無菌條件下稱取15 g肉樣，剪碎，將肉樣放入200 mL錐形瓶中，加入150 mL生理鹽水，在搖床上37 ℃條件下振搖40 min，結束后靜置10 min，取上層液體轉移到滅菌的50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，吸取上清液轉移至新的滅菌離心管中，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取沉淀于2 mL滅菌的離心管中;根據細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取細菌總DNA，提取結束后將其溶于50～100 μL試劑盒所帶TE緩沖液（由Tris和乙二胺四乙酸配制而成）中，用瓊脂糖電泳進行檢驗，如450～500 bp處有條帶說明DNA提取成功，將細菌總DNA在-20 ℃條件下保存，用于PCR擴增。

1.3.4 PCR擴增

對提取的細菌總DNA 16S rDNA的V6～V8區片段進行PCR擴增，選用引物序列[23-24]：上游引物帶GC夾子的U968為5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3、下游引物L1401為5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，以上引物均由新疆昆泰銳生物技術有限公司合成。

PCR反應體系（25 μL）：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL、引物各1 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL。

PCR擴增程序[25]：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，30 個循環;72 ℃延伸2 min。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，如有明亮條帶出現，說明DNA提取并擴增成功，將PCR產物在-20 ℃條件下冷凍保存，用于DGGE分析。

1.3.5 DGGE分析

對細菌16S rDNA的V6～V8區片段擴增產物進行DGGE分析：按照韓鮮娜[26]的方法進行制膠;用蠕動泵將高質量濃度和低質量濃度膠灌進DGGE制膠玻璃板，凝固后再用醫用無菌注射器灌濃縮膠，完全凝固后將制膠裝置放入裝有3/5電泳緩沖液的電泳槽內，先在200 V電壓下預電泳10 min，隨后在90 V電壓下電泳16 h[27]。

電泳結束后，按照韓鮮娜[26]的方法，取出膠片置于干凈的不銹鋼容器中，倒入250 mL 1×固定液，振搖3 min;倒掉固定液，再加入250 mL銀染溶液，振搖15 min;倒掉銀染溶液，用去離子水對凝膠和容器進行清洗后，倒入250 mL去離子水，振搖2 min;倒掉去離子水，加入顯色液，振搖至出現清晰條帶為止;棄去顯色液，加入250 mL 1×固定液，振搖5 min;棄去固定液，進行照相和割膠。

1.3.6 DNA回收、純化、測序

DNA回收：將染色后的DGGE膠片置于白光板上，用無菌手術刀切下DGGE膠上不同位置的條帶，分別放入1.5 mL滅菌離心管中，再加入20 μL蒸餾水，置于4 ℃條件下過夜。

DNA測序：以回收的DNA為模板，取2 μL進行16S rDNA V6～V8區域的擴增，上游引物U968為5-AACGCGAAGAACCTTAC-3，下游引物L1401為5-CGGTGTGTACAAGACCC-3，PCR擴增方法同1.3.4節。擴增后的PCR產物進行瓊脂糖電泳檢驗，在450～500 bp處有明亮條帶出現可以證明該回收DNA的存在，然后將剩余PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

測序后獲得16S rDNA基因片段序列，通過NCBI中的BLAST將所得序列與數據庫中已知序列進行相似性比對。

2 結果與分析

2.1 干腌羊火腿細菌總DNA提取結果

S. 0.05%生姜蛋白酶處理組;M. 0.05%獼猴桃蛋白酶處理組。下同。

采用DNA提取試劑盒在無菌條件下從不同干腌羊火腿中提取細菌總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖1可知，各組樣品均得到明亮條帶，說明提取方法得當，提取效果良好，可以進行后續實驗。

2.2 細菌16S rDNA V6～V8可變區PCR擴增結果

以干腌羊火腿細菌總DNA為模板，用引物對

16S rDNA V6～V8可變區進行擴增，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約450～500 bp的特異性片段。由

圖2可知，各組樣品均有明亮的擴增條帶出現，說明本研究的PCR擴增條件合適，得到的PCR擴增產物可以進行后續DGGE分析。

2.3 干腌羊火腿中微生物DGGE圖譜主要條帶序列分析

由圖3可知，同一泳道、不同位置的條帶代表不同的微生物。選擇DGGE圖譜中的條帶進行割膠、測序，登錄NCBI用BLAST在GenBank數據庫與已知序列進行相似性分析，所測序列大小均為415 bp左右，分析結果如表1所示。結合圖3和表1分析可知，表皮巨球菌（條帶4）、腐生葡萄球菌（條帶8）、土壤葡萄球菌（條帶9）、哈夫尼亞菌（條帶12）、明串珠菌（條帶14）等為各組干腌羊火腿加工過程中的主要優勢菌，并均存在于各組干腌羊火腿加工的各階段。腐生葡萄球菌（條帶1和2）、表皮巨球菌（條帶3）、條帶5、琥珀葡萄球菌（條帶6）也存在于干腌羊火腿加工過程中的各個階段，但條帶較暗。腐生葡萄球菌（條帶7）主要存在于獼猴桃蛋白酶處理組，木糖葡萄球菌（條帶11）主要存在于生姜蛋白酶處理組成熟期（S組30 d）和獼猴桃蛋白酶處理組成熟期（M組30 d）。明串珠菌（條帶13）存在于各取樣階段，但獼猴桃蛋白酶處理組成熟期條帶顏色最深。明串珠菌（條帶10和15）均存在于加工過程，但條帶較細。條帶16存在于各加工階段，對照組23 d和M組30 d條帶最為明顯，但測序失敗。Allobranchiibius huperziae（條帶17）存在于各加工階段。

3 討 論

目前利用PCR-DGGE法檢測肉制品中微生物的研究較多，且主要集中在發酵香腸的微生物區系、香腸成熟過程中微生物種群的動態變化研究等方面。采用PCR-DGGE法對各階段干腌羊火腿中微生物菌相變化進行研究，結果表明，整體來說，各組干腌羊火腿細菌多樣性較為豐富。

微生物在干腌火腿風干成熟過程中的作用不可忽視。大量研究表明，乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌等是火腿和發酵香腸等傳統腌制肉制品中的常見微生物。干腌羊火腿的微生物主要來自于腌制以及風干過程中表面微生物的入侵。本研究結果表明，葡萄球菌、明串珠菌、表皮巨球菌、哈夫尼亞菌是干腌羊火腿的優勢菌，其中葡萄球菌的種類較其他菌種多。張波等[10]對風干羊肉的揮發性風味物質進行研究得出，葡萄球菌為優勢菌種;黃艾祥[28]對云南牛肉干巴和云南干腌火腿進行研究得出同樣的結果。肉制品中生長的乳酸菌和葡萄球菌可以分解肉中的蛋白質，并有助于產生大量風味物質，從而提高產品營養價值[29-30]。本研究中，各組干腌羊火腿加工前期和后期的微生物組成較穩定，原因可能是腌制期溫度較低，對火腿內部微生物有抑制作用，在后續風干過程中溫度逐步上升，火腿的鹽含量也上升，對微生物的生長有抑制作用。

4 結 論

通過PCR-DGGE技術對添加生姜蛋白酶和獼猴桃蛋白酶的干腌羊火腿微生物菌相變化進行研究，結果表明：腐生葡萄球菌、表皮巨球菌、土壤葡萄球菌、哈夫尼亞菌、明串珠菌是各組干腌羊火腿的優勢菌，其中葡萄球菌屬種類較多;2 種蛋白酶可豐富干腌羊火腿中微生物的種類，2 種蛋白酶處理組成熟期30 d時均出現木糖葡萄球菌;在整個加工過程中，干腌羊火腿微生物菌相變化較穩定，受2 種蛋白酶的影響不大。

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收稿日期：2020-01-13

基金項目：國家自然科學基金地區科學基金項目（31260381）

第一作者簡介：阿爾祖古麗·阿卜杜外力（1992—）（ORCID： 0000-0001-7367-5699），女，碩士研究生，研究方向為畜產品加工。E-mail： 17699336132@163.com

通信作者簡介：巴吐爾·阿不力克木（1968—）（ORCID： 0000-0002-6873-9632），男，教授，博士，研究方向為肉品加工與質量控制。E-mail： batur6805@126.com