受激輻射損耗超分辨顯微成像系統(tǒng)研究的新進(jìn)展*

王佳林 嚴(yán)偉 張佳 王璐瑋 楊志剛 屈軍樂(lè)

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳 518060)(2020年2月2日收到; 2020年3月11日收到修改稿)

由于受到衍射極限的影響, 傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在半個(gè)波長(zhǎng)左右. 近二十年來(lái)出現(xiàn)了許多通過(guò)不同方法繞過(guò)光學(xué)衍射極限的超分辨成像技術(shù), 其中, 受激輻射損耗顯微(stimulated emission depletion microscopy, STED)通過(guò)引入一束環(huán)形損耗光來(lái)抑制熒光光斑外圍熒光分子的發(fā)光, 以達(dá)到減小點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的目的, 實(shí)現(xiàn)超分辨成像. 經(jīng)過(guò)近些年的發(fā)展, STED 系統(tǒng)無(wú)論從光束的產(chǎn)生、校準(zhǔn)和掃描, 還是最后的成像,都有了很大的發(fā)展. 本文將簡(jiǎn)要介紹STED 成像技術(shù)的基本原理, 詳述STED 超分辨成像技術(shù)出現(xiàn)至今在光源、掃描及成像系統(tǒng)等方面的進(jìn)展, 以及在三維成像和多色成像方面的發(fā)展現(xiàn)狀, STED 技術(shù)與其他顯微技術(shù)的結(jié)合. 最后, 本文對(duì)STED 技術(shù)近幾年的研究新進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)的論述, 對(duì)STED 技術(shù)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了探討.

1 引 言

早在1665年, 英國(guó)科學(xué)家羅伯特·胡克(R.Hooke)首次利用自制的顯微鏡觀察到植物細(xì)胞并提出“cell”的概念, 自此以來(lái)顯微鏡與生物學(xué)之間形成了密不可分的關(guān)系. 隨著科學(xué)的進(jìn)步與技術(shù)的發(fā)展, 生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ谏矬w結(jié)構(gòu)的觀察已經(jīng)從微米尺度提高到了納米尺度, 這對(duì)顯微鏡的顯微性能提出了更高的要求. 縱觀顯微技術(shù)的發(fā)展歷史,在十九世紀(jì)末, 德國(guó)物理學(xué)家恩斯特·阿貝(Ernst K. Abbe)提出了光學(xué)衍射極限的概念, 認(rèn)為成像系統(tǒng)的橫向與軸向分辨率均受到衍射極限的限制.即使光學(xué)顯微鏡經(jīng)過(guò)了幾百年的發(fā)展, 顯微鏡的成像性能已經(jīng)有了巨大的飛躍, 但依然受到光學(xué)衍射極限的限制, 橫向分辨率一般被限制在200 nm 左右, 軸向分辨率被限制在500 nm 左右, 該極限分辨率已然無(wú)法滿足日益發(fā)展的生物科學(xué)研究的需求. 直到二十世紀(jì)九十年代, 科研人員才陸續(xù)提出各種可以突破衍射極限的顯微技術(shù), 這些顯微技術(shù)統(tǒng)稱(chēng)為超分辨顯微技術(shù). 超分辨顯微技術(shù)的發(fā)明,對(duì)于生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等領(lǐng)域有著非常重要的意義. 在眾多超分辨顯微技術(shù)中, 由德國(guó)科學(xué)家Hell和Wichmann 于1994年提出的STED 超分辨顯微技術(shù)[1], 經(jīng)過(guò)近幾年來(lái)的發(fā)展已經(jīng)十分成熟, 應(yīng)用范圍也非常廣泛.

本文將介紹STED 的基本原理及系統(tǒng)的主要組成部分, 重點(diǎn)介紹近年來(lái)STED 技術(shù)各方面性能提升的實(shí)現(xiàn)方式以及STED 與其他技術(shù)相結(jié)合的情況.

2 STED 顯微技術(shù)的基本原理及其系統(tǒng)的主要組成部分

2.1 STED 顯微技術(shù)的基本原理

傳統(tǒng)光學(xué)顯微技術(shù)即使在很大程度上消除了像差和提高了放大倍率, 但其分辨率始終無(wú)法實(shí)現(xiàn)突破, 主要是受到光學(xué)系統(tǒng)衍射效應(yīng)的限制, 即一個(gè)理想的物點(diǎn)在經(jīng)過(guò)光學(xué)系統(tǒng)成像后, 在成像面上形成具有一定尺寸的衍射斑. 觀測(cè)物可以被視為由多個(gè)物點(diǎn)組成, 在像面上則會(huì)形成多個(gè)衍射光斑,當(dāng)衍射光斑之間的距離近到一定程度時(shí)就無(wú)法區(qū)分開(kāi), 稱(chēng)為衍射極限. 在熒光顯微鏡中, 被衍射光斑照射的區(qū)域發(fā)出熒光, 形成一個(gè)熒光光斑.STED 技術(shù)針對(duì)熒光光斑受衍射影響而擴(kuò)大的情況, 對(duì)光束進(jìn)行空域上的調(diào)制, 有效地壓縮了光斑的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(point spread function, PSF), 實(shí)現(xiàn)超分辨成像. 具體原理是: 利用兩束激光來(lái)進(jìn)行顯微成像, 其中一束為激發(fā)光, 用于激發(fā)熒光分子;另一束是中心強(qiáng)度為零的中空形圓環(huán)狀STED 光(也稱(chēng)為損耗光), 其與激發(fā)光共軸且波長(zhǎng)與熒光分子發(fā)射波長(zhǎng)匹配. 激發(fā)光使基態(tài)能級(jí)S0上的電子躍遷到激發(fā)態(tài)能級(jí)S1, 在沒(méi)有外界干擾的情況下這些激發(fā)態(tài)的電子將會(huì)以自發(fā)輻射熒光的形式回落到基態(tài), 如果處在激發(fā)態(tài)的電子在環(huán)形STED 光照射下將會(huì)發(fā)生受激輻射效應(yīng), 導(dǎo)致STED 光照射區(qū)域產(chǎn)生光子的波長(zhǎng)有別于自發(fā)輻射區(qū)域的光子波長(zhǎng), 相較于自發(fā)輻射區(qū)域,STED 光照射區(qū)域分子處于暗態(tài), 視為不發(fā)熒光(如圖1(a)). 由于兩束光重疊區(qū)域產(chǎn)生受激輻射,只有中心區(qū)域發(fā)出熒光, 因此減小了激發(fā)光斑的有效面積, 即減小了PSF, 實(shí)現(xiàn)了空間分辨率的提高(如圖1(b)). STED 系統(tǒng)的橫向空間分辨率, 可用公式表示為

其中l(wèi)為激發(fā)光的波長(zhǎng),NA是物鏡的數(shù)值孔徑,ISTED和Is分別對(duì)應(yīng)STED 光的光強(qiáng)和飽和受激輻射光強(qiáng). 飽和光強(qiáng)Is= 1/(tfls)由具體染料的熒光壽命tfl和STED 光的吸收截面s共同決定. 由此可知, 可以通過(guò)增加STED 光強(qiáng)度的方法提高成像的分辨率, 理論上STED 系統(tǒng)的分辨率可以提高到無(wú)限高, 但是在實(shí)際應(yīng)用時(shí)要考慮到熒光材料的光漂白性, 特別是生物樣品的光毒性等, 因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí)要根據(jù)目標(biāo)樣品的不同采取不同的STED 光強(qiáng)度.

2.2 STED 系統(tǒng)的基本組成

典型的點(diǎn)掃描式STED 系統(tǒng)一般由光源(圖2紅色虛線框)、光束耦合單元(圖2 綠色虛線框)、掃描單元(圖2 橙色虛線框)與成像單元(圖2 藍(lán)色虛線框)等四個(gè)部分組成.

圖1 STED 的原理圖 (a)能級(jí)輻射示意圖; (b)光束重合示意圖Fig. 1. The concept of STED: (a)The concept of stimulated emission; (b)the overlapping of beams.

一般的單色STED 超分辨成像系統(tǒng)需要兩個(gè)單波長(zhǎng)輸出的激光器作為光源, 第一個(gè)激光器產(chǎn)生激發(fā)光束, 其波長(zhǎng)處于熒光分子激發(fā)譜的波峰附近. 第二個(gè)激光器產(chǎn)生STED 光束, 其波長(zhǎng)處于熒光分子發(fā)射譜的拖尾附近, 避免對(duì)熒光分子產(chǎn)生二次激發(fā). 此外, 脈沖光在時(shí)間上具有可分離性, 為了保證激發(fā)光與STED 光到達(dá)樣品時(shí)的先后順序,激發(fā)光與STED 光一般都是脈沖光. 在光源的強(qiáng)度上, 為了保證一定的擦除效果以獲得高的分辨率, STED 系統(tǒng)中的STED 光強(qiáng)度一般為10—103mW量級(jí).

要實(shí)現(xiàn)對(duì)PSF 的調(diào)制, 關(guān)鍵是需要對(duì)STED光進(jìn)行調(diào)制, 并保證激發(fā)光束與STED 光束高度重合. 一般使用渦旋相位板(vortex phase plate,VPP)或空間光調(diào)制器(spatial light modulator,SLM)來(lái)對(duì)STED 光的波前進(jìn)行調(diào)制以產(chǎn)生環(huán)形光, 其中心強(qiáng)度趨近于零的區(qū)域必須小于激發(fā)光的光斑大小. 利用二向色鏡對(duì)STED 光與激發(fā)光的反射率和透射率的不同來(lái)實(shí)現(xiàn)激發(fā)光與STED 光的重合, 不僅要實(shí)現(xiàn)橫截面上兩個(gè)光斑的重合, 也要保證在Z軸上高度重合. 此外, 二向色鏡還需要對(duì)樣品返回的熒光有透射作用.

激發(fā)光與STED 光重合之后, 通過(guò)掃描單元如掃描振鏡, 實(shí)現(xiàn)光斑在樣品上的掃描, 從而實(shí)現(xiàn)二維面陣成像. 在點(diǎn)掃描STED 成像系統(tǒng)中, 掃描單元的掃描速度直接決定了系統(tǒng)的成像速度.

圖2 STED 系統(tǒng)圖Fig. 2. The setup of STED system.

3 STED 系統(tǒng)的發(fā)展

3.1 STED 系統(tǒng)光源部分的改進(jìn)

為了實(shí)現(xiàn)更高的空間分辨率, STED 系統(tǒng)通常需要具有很高功率的STED 光, 因此, 在早期的STED 系統(tǒng)中, 激發(fā)光多為皮秒激光器, 而STED光通常是對(duì)具有很高功率的飛秒激光器進(jìn)行展寬而得到的高能寬脈沖激光, 所達(dá)到的最高分辨率為2.4 nm[2]. 雖然用飛秒激光器作為STED 光能夠獲得超高的分辨率, 但是飛秒激光器成本高, 難以普及. 對(duì)于早期的STED 系統(tǒng), 最常用的光源是脈沖寬度80 ps 的激發(fā)光與脈沖寬度200 fs 的STED光. 其中, STED 光需要進(jìn)行約1000 倍的脈沖展寬. 此外, 還需要將激發(fā)光與STED 光進(jìn)行時(shí)間同步, 確保STED 光脈沖在樣品已經(jīng)被激發(fā)到激發(fā)態(tài)但是還沒(méi)有發(fā)生自發(fā)輻射的這個(gè)時(shí)間段到達(dá)樣品, 這使得脈沖型STED 系統(tǒng)較為復(fù)雜. 脈沖光在帶來(lái)更高峰值功率的同時(shí), 也更容易對(duì)生物活體樣品造成損傷.

2007年, Willig 等[3]發(fā)現(xiàn)可以利用連續(xù)光(continuous wave, CW)進(jìn)行STED 成像. 若CW激發(fā)光以Kexc的速率進(jìn)行激發(fā)時(shí), 認(rèn)為S1被電子填充的概率為N1:

其中熒光衰減率Kfl= 1/tfl為熒光壽命tfl的倒數(shù),且N1< 1. 當(dāng)加入強(qiáng)度為ISTED, 受激輻射分子截面為s的CW-STED 光時(shí), 則引入了一個(gè)額外的衰減率KSTED=sISTED, 此時(shí)S1被填充的概率變?yōu)?/p>

當(dāng)STED 光束強(qiáng)度ISTED滿足

則有KSTED>Kexc>Kfl, 此時(shí)STED 占主導(dǎo)地位. 進(jìn)一步加強(qiáng)STED 光束的強(qiáng)度, 就能夠使KSTED?Kexc, 在這種情況下N1?1, 意味著無(wú)論激發(fā)光與STED 光的時(shí)間順序如何, S1能級(jí)上的電子都會(huì)由于受激輻射迅速回到S0能級(jí). 也就是說(shuō), 當(dāng)激發(fā)光束的激發(fā)速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于STED 光的受激輻射速率時(shí), 激發(fā)光束與STED 光束時(shí)間順序的同步變得不再重要. 最終, Willig 等[3]在實(shí)驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)了CW-STED 系統(tǒng)的超分辨成像, 達(dá)到了29 nm 的分辨率. 使用CW 光作為STED 系統(tǒng)的光源, 不僅可以在相同平均功率下保證較小的峰值功率, 而且使得STED 系統(tǒng)更加簡(jiǎn)化.

3.1.1 使用超連續(xù)脈沖激光器作為光源

2008年Wildanger 等報(bào)道了一種基于光子晶體光纖的超連續(xù)譜STED 顯微鏡[4], 這種STED顯微鏡使用單一的超連續(xù)譜激光器作為光源, 利用偏振分束器(polarization beam splitter, PBS)得到了用于激發(fā)和損耗的兩束光. 對(duì)于激發(fā)光, 使用干涉濾波片(interference filter, EF)分離出所需要的激發(fā)波長(zhǎng). 對(duì)于STED 光, 使用布儒斯特棱鏡構(gòu)建的波長(zhǎng)選擇器(wavelength selector, WS)來(lái)篩選波長(zhǎng). 該波長(zhǎng)選擇器的出口設(shè)置了一個(gè)位置與寬度可變的狹縫, 通過(guò)改變狹縫的位置與寬度可以選擇STED 光的中心波長(zhǎng)與光譜寬度, 以輸出所需STED 光(圖3).

圖3 基于超連續(xù)譜光源的STED 系統(tǒng)[4]Fig. 3. STED system based on supercontinuum laser source[4].

該系統(tǒng)在保證超分辨效果的前提下, 簡(jiǎn)化了光源, 降低了STED 系統(tǒng)的成本, 同時(shí)提高了STED 光的可調(diào)諧性. 理論上, 該系統(tǒng)通過(guò)移動(dòng)狹縫位置可以實(shí)現(xiàn)多色成像, 然而實(shí)際操作上受到雙色鏡透過(guò)率的限制, 實(shí)現(xiàn)多色成像的難度較大.

3.1.2 使用多色受激拉曼散射光作為光源

優(yōu)化系統(tǒng)光源是改進(jìn)STED 系統(tǒng)的重點(diǎn)方向之一, 使用連續(xù)光作為STED 的光源, 不僅可降低系統(tǒng)成本, 而且使多色成像成為可能. Rankin 等[5]在2008年嘗試了使用多色受激拉曼散射(stimulated Raman scattering, SRS)光 源 作 為STED 系統(tǒng)的STED 光(圖4(a)).

受激拉曼散射效應(yīng)是指當(dāng)入射到工作介質(zhì)(如石英光纖)的激光足夠強(qiáng)時(shí), 會(huì)在光纖中產(chǎn)生具有較高強(qiáng)度的拉曼散射光(頻率在激發(fā)光頻率到分子簡(jiǎn)正振動(dòng)頻率范圍內(nèi)), 當(dāng)入射光強(qiáng)度超越一定閾值時(shí), 對(duì)應(yīng)的散射光也足以成為單獨(dú)的輻射光源, 從而激發(fā)另一頻率范圍的拉曼散射光. 如此反復(fù), 便能產(chǎn)生一系列頻率的拉曼散射光. 該系統(tǒng)中, 利用脈沖長(zhǎng)度為1 ns, 光譜帶寬為0.3 nm的532 nm的激光作為初始光源, 通過(guò)SRS 光纖發(fā)生受激拉曼散射效應(yīng), 產(chǎn)生了一系列波長(zhǎng)的散射光(圖4(b)), 利用帶通濾波器可選擇出合適波長(zhǎng)的STED 光進(jìn)行超分辨成像. 使用受激拉曼散射光作為STED光, 具有系統(tǒng)緊湊和STED 光波長(zhǎng)可選的特點(diǎn), 是多色STED 超分辨成像的基礎(chǔ), 但是該系統(tǒng)的主要缺點(diǎn)是需要功率較高的脈沖光源,對(duì)光源的要求仍然較高, 對(duì)于活體成像也有一定的限制.

圖4 基于受激拉曼散射光源的STED 系統(tǒng)示意圖[5](a)基于受激拉曼散射光源的多色STED 系統(tǒng); (b)激光器在光纖中的SRS 輸出光譜Fig. 4. Simplified schematic of a STED system with a stimulated Raman-scattering light source[5]: (a) Multicolor STED system with stimulated Raman-scattering laser source; (b) output spectrum from the SRS fiber.

3.1.3 使用高斯-拉蓋爾矢量光束作為STED光源

環(huán)形STED 光的產(chǎn)生, 對(duì)實(shí)現(xiàn)STED 超分辨成像非常重要. 傳統(tǒng)的STED 系統(tǒng)一般是采用VPP或SLM 進(jìn)行波前調(diào)制產(chǎn)生環(huán)形光, T?r?k 等[6]報(bào)道了利用高斯-拉蓋爾(Gauss-Laguerre)矢量光束作為環(huán)形STED 光, 在不同深度的焦面上均能保證較好的零強(qiáng)度.

傳統(tǒng)的高斯環(huán)形光在沒(méi)有畸變的條件下能夠在聚焦位置產(chǎn)生較好的零強(qiáng)度(圖5 點(diǎn)劃線), 然而當(dāng)聚焦深度增加且出現(xiàn)像差時(shí), 其能量分布將發(fā)生移動(dòng), 并且聚焦位置的強(qiáng)度不再為零(圖5 實(shí)線).相反地, 高斯-拉蓋爾環(huán)形光則可以不受像差畸變的影響, 在光軸上保持穩(wěn)定的零強(qiáng)度(圖5 虛線),能夠保證STED 光束在不同焦面深度的受激輻射效率.

圖5 TED 光強(qiáng)度的分布曲線[6]Fig. 5. The intensity distributions of depletion beam[6].

3.1.4 使用貝塞爾光作為STED 光源

使用高斯光形成的STED 光進(jìn)行STED 成像, 由于球面像差、散射畸變和損耗等因素, 當(dāng)焦點(diǎn)從樣品表面移到樣品深處時(shí), 通常無(wú)法保持一致的分辨率. 2016年北京大學(xué)Yu 等[7]利用貝塞爾光束(Bessel-beam)無(wú)畸變的特性, 將環(huán)形貝塞爾光束作為STED 光進(jìn)行STED 成像(GB-STED),在固體瓊脂糖樣品和類(lèi)腦組織灰質(zhì)中分別達(dá)到了155 μm (圖6 左) 和100 μm (圖6 右)深度的超分辨成像.

由于貝塞爾光束在不同成像深度上能保持高的空間分辨率, Zhang 等[8]在其深度成像的基礎(chǔ)上, 將點(diǎn)掃描改為線掃描, 搭建了貝塞爾STED 光片成像系統(tǒng), 有效地提升了STED 系統(tǒng)的成像速度, 降低了光損傷. 在系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)上, 將零級(jí)貝塞爾光作為系統(tǒng)的激發(fā)光(圖7(a)), 比二階貝塞爾光效率更高的一階貝塞爾光作為STED 光(圖7(c)),通過(guò)高階貝塞爾光束來(lái)耗盡貝塞爾激發(fā)光周?chē)淖园l(fā)輻射, 可以將光片的厚度減小到衍射極限. 與傳統(tǒng)的點(diǎn)掃描STED 顯微鏡相比, 線掃描貝塞爾光束STED(BB-STED)顯微鏡具有更快的成像速度, 能夠?qū)Υ篌w積樣品實(shí)現(xiàn)快速成像. 此外,由于BB-STED 使用平面照明光限制樣品的薄層,從而顯著減少了焦平面上方和下方的光漂白和光損傷.

與高斯光束相比, 貝塞爾光束的光斑會(huì)不可避免地出現(xiàn)旁瓣, 使用相消干涉的方法來(lái)使邊帶最小化可以在一定程度上減少貝塞爾光束的旁瓣強(qiáng)度.

圖6 共聚焦、傳統(tǒng)STED與貝塞爾STED成像的分辨率隨成像深度的變化曲線[7] (a) 40 nm 熒光珠在固體瓊脂糖樣品不同深度成像的分辨率; (b) 40 nm 熒光珠在類(lèi)腦組織灰質(zhì)不同深度成像的分辨率Fig. 6. Imaging curves of Confocal、traditional STED and Bessel-STED[7]: (a) Resolution of 40 nm fluorescent beads at different depths of solid agarose samples; (b) resolution of 40 nm fluorescent beads at different depths of like-gray matter in brain tissue.

圖7 零階貝塞爾激發(fā)光與高階貝塞爾STED 光[8] (a)零階貝塞爾激發(fā)光在XY 平面的光強(qiáng)分布; (b)零階貝塞爾激發(fā)光的光強(qiáng)曲線; (c)一階貝塞爾STED 光在XY 平面的光強(qiáng)分布; (d)一階(黑色)與二階(紅色)貝塞爾STED 光的光強(qiáng)曲線Fig. 7. The zero-order Bessel beam for excitation and the higher-order Bessel beam for depletion[8]: (a) The intensity distribution of zero-order Bessel excitation beam in the XY plane.; (b) the intensity curve of zero-order Bessel excitation beam; (c) the intensity distribution of first-order Bessel depletion beam in the XY plane; (d) the intensity curve of first-order (black) and second-order(red)Bessel depletion beam.

3.2 STED 系統(tǒng)的光束校準(zhǔn)

STED 系統(tǒng)利用STED 光來(lái)抑制激發(fā)光外圍區(qū)域的熒光發(fā)射, 前提是需要對(duì)光路進(jìn)行精密準(zhǔn)確的校準(zhǔn), 使STED 光與激發(fā)光完全重合, 這對(duì)于系統(tǒng)操作提出了非常高的要求. 在傳統(tǒng)STED 系統(tǒng)中, 光束重合的精確度決定了STED 系統(tǒng)的成像質(zhì)量, 因此要想獲得高質(zhì)量的STED 圖像, 必須保證兩束光的高度重合.

3.2.1 自適應(yīng)光學(xué)自動(dòng)校準(zhǔn)

常規(guī)的STED 系統(tǒng)一般利用電荷耦合器(charge coupled device, CCD)等探測(cè)器成像對(duì)光束進(jìn)行粗略的調(diào)節(jié), 然后再使用金納米顆粒的散射成像進(jìn)行細(xì)微調(diào)節(jié), 直至兩束光的PSF 完全對(duì)準(zhǔn).這種光束重合的調(diào)節(jié)方式, 一方面需要進(jìn)行手動(dòng)調(diào)節(jié), 另一方面需要切換反射成像模式, 不僅操作繁瑣, 而且反射和熒光成像模式之間的不匹配也可能引起其他問(wèn)題. 針對(duì)這一問(wèn)題, Gould 等[9]提出了使用自適應(yīng)光學(xué)實(shí)現(xiàn)光束自動(dòng)對(duì)準(zhǔn)的方法, 可以實(shí)現(xiàn)4.3 ± 2.3 nm 的對(duì)準(zhǔn)精度. 具體地, 通過(guò)在STED光束的路徑中放置空間光調(diào)制器(SLM), 在SLM 上輸入STED 相位掩模產(chǎn)生環(huán)形光束, 并施加在X和Y方向上的已知傾斜量來(lái)獲取STED圖像. 對(duì)獲取的STED 圖像的圖像亮度和清晰度進(jìn)行分析計(jì)算, 當(dāng)STED 光焦點(diǎn)的零強(qiáng)度位置對(duì)準(zhǔn)激發(fā)光焦點(diǎn)的中心時(shí), STED 圖像最亮, 且清晰度最高; 當(dāng)STED 光束與激發(fā)光束重疊不好時(shí), 得到的STED 圖像與重疊比較好的STED 圖像對(duì)比, 圖像的亮度和清晰度都會(huì)降低. 利用亮度與清晰度兩個(gè)指標(biāo), 能夠?qū)馐膶?duì)準(zhǔn)效果提供可靠的判斷標(biāo)準(zhǔn).

利用自適應(yīng)光學(xué), 可以對(duì)熒光樣品進(jìn)行程序?qū)?zhǔn)操作來(lái)代替手動(dòng)調(diào)節(jié)(圖8(a)—圖8(f)), 從而極大簡(jiǎn)化STED 光與激發(fā)光的對(duì)準(zhǔn).

3.2.2 雙折射裝置實(shí)現(xiàn)光束校準(zhǔn)

Reuss 等[10]提出了利用雙折射裝置進(jìn)行光束對(duì)準(zhǔn)的方法, 稱(chēng)為easy-STED, 提高了光束的穩(wěn)定性和操作的簡(jiǎn)易性. 常規(guī)的VPP 不能在同一位置對(duì)不同波長(zhǎng)的光束進(jìn)行有效區(qū)分, 利用雙折射晶體作為光束整形裝置, 當(dāng)激發(fā)光與STED 光通過(guò)該整形裝置后, 只有STED 光的波前被調(diào)制成為中空環(huán)形分布, 而激發(fā)光則不受影響. 具體來(lái)說(shuō), 該光束整形裝置的中心部分是具有四個(gè)快軸方向的組合波片, 該組合波片由一個(gè)較大的波片切割成四個(gè)部分并以一定的快軸方向夾角重新黏合到共同的基底上得到(如圖9(a)左側(cè)). 不同的快軸方向?qū)馐癞a(chǎn)生不同的效果, 因而產(chǎn)生方位角偏振光束. 以波長(zhǎng)532 nm 的激發(fā)光及對(duì)應(yīng)647 nm 的STED 光為例, 相應(yīng)波片對(duì)激發(fā)光產(chǎn)生的延遲約是3l, 對(duì)STED 光產(chǎn)生的延遲是2.5l. 因此, STED光會(huì)產(chǎn)生一個(gè)半波延遲, 導(dǎo)致偏振面旋轉(zhuǎn), 而激發(fā)光則不受影響. 另外, 結(jié)合消色差半波片, 可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)STED 光束的環(huán)形聚焦, 而激發(fā)光則聚焦成標(biāo)準(zhǔn)的衍射光斑.

圖8 STED 光束與激發(fā)光束的對(duì)準(zhǔn)結(jié)果[9] (a)激發(fā)光與STED 光未對(duì)準(zhǔn)時(shí)的金納米顆粒圖像; (b) (a)中激發(fā)光與STED 光未對(duì)準(zhǔn)時(shí)所得到的熒光珠的共聚焦(綠色)與STED(紅色)圖像的合并; (c)沿圖(b)中所示虛線的信號(hào)強(qiáng)度曲線: 共聚焦(綠色)和STED(紅色); (d)激發(fā)光與STED 光對(duì)準(zhǔn)情況下的金納米顆粒圖像; (e) (d)中激發(fā)光與STED 光對(duì)準(zhǔn)時(shí)所得到的熒光珠的共聚焦(綠色)與STED(紅色)圖像的合并; (f)沿圖(e)中所示直線和點(diǎn)劃線的信號(hào)強(qiáng)度曲線: 共聚焦(綠色)和STED(紅色)Fig. 8. Alignment results of depletion and excitation beams[9]: (a) Merged result of the excitation focus (green) and a poorly aligned depletion focus(red) using gold nanoparticles; (b) merged result of corresponding confocal (green) and STED(red) images of fluorescent beads imaged with the focus shown in (a); (c) line profiles across the dotted line in (b): confocal (green) and STED (red);(d) merged image of the excitation focus (green) and a well aligned depletion focus (red); (e) merged result of corresponding confocal (green) and STED (red) images of fluorescent beads imaged with the focus shown in (d); (f) line profiles across the solid and dashed lines in (e): confocal (green) and STED (red).

圖9(a)右側(cè)表示在光束整形裝置不同階段和周期的兩個(gè)代表點(diǎn)處激發(fā)光束和STED 光束的偏振狀態(tài). 由于分段波片的波長(zhǎng)性質(zhì), 兩個(gè)光束會(huì)受到不同的影響. 首先, 兩個(gè)線偏振光束由消色差四分之一波片(quarter-wave plate, QWP)變?yōu)閳A偏振光. 然后, 通過(guò)分段波片對(duì)STED 光束選擇性地旋轉(zhuǎn)偏振. 最后, 二分之一波片選擇性地反轉(zhuǎn)兩個(gè)光束的水平偏振分量, 反轉(zhuǎn)激發(fā)光束的圓偏振并將STED 光束轉(zhuǎn)換成環(huán)形光. 對(duì)于激發(fā)光, 則形成正常聚焦的光斑. 由于組合波片是四個(gè)波片拼合而成的, 形成的環(huán)形光束不是完全規(guī)則的圓形環(huán), 如圖9(b)所示.

3.2.3 簡(jiǎn)易的空間光調(diào)制器校準(zhǔn)

與easy-STED 類(lèi)似, 2018年G?rlitz 等[11]研究人員提出將激發(fā)光與STED 光耦合到光纖中進(jìn)行重合, 然后利用SLM 對(duì)激發(fā)光和STED 光分別進(jìn)行光束整合, 稱(chēng)為easySLM-STED, 進(jìn)一步簡(jiǎn)化了光束重合的復(fù)雜度, 提高了光束重合的穩(wěn)定性.如圖10 所示, 利用SLM 相位調(diào)制只能作用于一個(gè)線性偏振的特性, 結(jié)合偏振方向正交的激發(fā)光與STED 光, 再利用QWP 旋轉(zhuǎn)偏振的特性, 就可以對(duì)重合的激發(fā)光與STED 光分別進(jìn)行獨(dú)立的調(diào)制,使得只有STED 光被調(diào)制為環(huán)形光.

盡管能在空間上實(shí)現(xiàn)對(duì)準(zhǔn), 但是STED 光束具有軌道角動(dòng)量, 因此, STED 系統(tǒng)的性能通常容易受到熱變化和振動(dòng)的影響, 穩(wěn)定性較差, 使用Qplate 可以解決這個(gè)問(wèn)題[12].

圖9 雙折射光束整形示意圖[10] (a) easy-STED 雙折射光束整形裝置示意圖; (b)光斑重合效果Fig. 9. Schematic of birefringent beam shaping[10]: (a) Schematic of an easy-STED microscope using a birefringent beam shaping device; (b) merged image of the excitation beam and a depletion beam.

圖10 asySLM-STED 系統(tǒng)示意圖[11]Fig. 10. Schematic diagram of easySLM-STED system[11].

3.3 STED 系統(tǒng)的掃描單元

熒光成像, 包括STED 成像的質(zhì)量在很大程度上取決于信號(hào)的強(qiáng)度, 在一定閾值內(nèi)熒光信號(hào)的強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)呈正相關(guān), 超過(guò)一定閾值后光吸收將趨于飽和并永久性地破壞熒光分子的激發(fā)態(tài), 發(fā)生光漂白. 光漂白是STED 系統(tǒng)成像質(zhì)量提高的一個(gè)重要的限制條件, 減少光漂白的一個(gè)有效途徑是提高掃描速度, 從而減少光斑在樣品上的停留時(shí)間. 由于STED 是基于點(diǎn)掃描成像的, 所以掃描速度對(duì)于光漂白有著直接的影響. 目前顯微鏡常用的掃描裝置有掃描振鏡和聲光偏轉(zhuǎn)器. 掃描振鏡主要是利用伺服電機(jī)控制鏡片擺動(dòng)來(lái)達(dá)到掃描的效果.這種光束掃描不需要移動(dòng)樣品, 僅靠鏡片的擺動(dòng)就可以達(dá)到每秒上千行的逐行掃描, 共振振鏡掃描更是可以達(dá)到每秒上萬(wàn)行的掃描速度, 振鏡是STED系統(tǒng)使用最廣泛的掃描裝置[13]. 聲光偏轉(zhuǎn)器是基于聲光效應(yīng), 通過(guò)控制施加在聲光晶體兩端超聲波的頻率來(lái)改變光束角度的一種掃描裝置, 有部分STED 系統(tǒng)使用聲光偏轉(zhuǎn)器進(jìn)行掃描[14]. 與機(jī)械式偏轉(zhuǎn)的掃描振鏡相比, 聲光偏轉(zhuǎn)器在掃描速度上有一定的差距, 但卻具有無(wú)振動(dòng)的優(yōu)勢(shì), 也有較好的穩(wěn)定性.

3.3.1 大視場(chǎng)共振掃描STED

提高STED 系統(tǒng)的掃描速度和掃描角度, 對(duì)樣品進(jìn)行大視場(chǎng)快速掃描, 能在有效減少光漂白的同時(shí)得到高分辨率的圖像. 目前主要通過(guò)快速共振掃描器件來(lái)實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)快速掃描, 減少曝光時(shí)間和光漂白. 但是, 提升掃描速度及掃描視場(chǎng)之后, 還必須具備相應(yīng)的快速光子計(jì)數(shù)系統(tǒng), 否則快速共振掃描得到的光子信息無(wú)法被及時(shí)捕獲, 也無(wú)法提升圖像的采集速率.

加州大學(xué)Wu 等[15,16]針對(duì)這種限制構(gòu)建了一個(gè)基于高速光子計(jì)數(shù)圖像采集系統(tǒng)的共振掃描CW-STED 顯微鏡, 具有超快的讀出速率, 優(yōu)異的計(jì)數(shù)線性度, 可實(shí)現(xiàn)在線時(shí)間門(mén)控檢測(cè). 利用現(xiàn)場(chǎng)可 編 程 門(mén) 陣 列(fieldprogrammable gate array,FPGA)實(shí)時(shí)記錄每個(gè)光子脈沖, 讀出速率最高可達(dá)450 MHz, 搭配8 KHz 的掃描振鏡, 與共振掃描時(shí)間選通CW-STED 顯微鏡相結(jié)合, 可以在較大視場(chǎng)(50 μm × 50 μm)下獲得具有較小光漂白的高分辨率圖像.

3.3.2 并行掃描STED

與提高掃描速度的方法不同, 并行掃描[17,18]STED 通過(guò)提高每次掃描的效率, 來(lái)增大掃描視場(chǎng), 減少光漂白. Wagner 等[17]提出了使用多波長(zhǎng)全息術(shù)[19]來(lái)生成激發(fā)和STED 光圖案: 設(shè)計(jì)一個(gè)由兩個(gè)平面組成的全息圖, 其中一個(gè)平面編碼生成激發(fā)圖案, 另一個(gè)平面編碼生成擦除圖案, 然后將全息圖編程到SLM 上. 通過(guò)選擇投影全息圖的位置和兩個(gè)圖像平面之間的距離, 可以確保激發(fā)光束和STED 光束圖案在一個(gè)平面上對(duì)齊. 使用這種方法, 可以同時(shí)將激發(fā)光束和STED 光束分成N個(gè)光束對(duì)(圖11(a),N= 8), 使視場(chǎng)增加N倍,極大地提高了掃描效率.

圖11 并行掃描STED 示意圖[17,18] (a)擴(kuò)展STED 光束對(duì)的結(jié)果; (b)多點(diǎn)掃描STED 光路示意圖Fig. 11. Schematic diagram of parallel scanning STED[17,18]: (a) Results of extended STED beam pairs; (b) optical path of the multipoint scanning STED.

然而, 這種并行掃描的缺點(diǎn)是, 使用相同的全息圖來(lái)產(chǎn)生激發(fā)光以及STED 光圖案, 意味著只有一半的功率用于成像, 能量利用率較低.Bingen 等[18]提出了另外一種產(chǎn)生多光束的方法,將非偏振的激發(fā)光與STED 光耦合進(jìn)光纖, 利用渥拉斯頓棱鏡(圖11(b)中的W1 與W2)將光束分為四個(gè)偏振的子光束. 經(jīng)過(guò)掃描電鏡后, 使用雙折射裝置(詳見(jiàn)3.2.2)對(duì)所有子光束進(jìn)行處理. 樣品發(fā)出的熒光被收集后聚焦到金字塔棱鏡上, 金字塔棱鏡將四個(gè)焦點(diǎn)的熒光分開(kāi)并分別聚焦在四個(gè)探測(cè)器上. 這種方法可以根據(jù)激光能量以及實(shí)際需求, 分出更多的子光束來(lái)提升掃描速度, 但是這種提高掃描效率的方法也極大地增加了系統(tǒng)的成本和操作的復(fù)雜性.

3.4 STED 系統(tǒng)的成像單元

STED 系統(tǒng)的成像單元包括接收信號(hào)的探測(cè)器以及對(duì)信號(hào)的處理. 對(duì)STED 系統(tǒng)探測(cè)器得到的信號(hào)進(jìn)行處理, 可進(jìn)一步提高成像的空間分辨率. 由于STED 光對(duì)所激發(fā)熒光的損耗, 使探測(cè)器接收到的有效熒光信號(hào)變得很弱, 因此必須使用高靈敏度的弱信號(hào)探測(cè)器, 如光電倍增管(photomultiplier tube, PMT)、雪崩光電二極管(avalanche photo diode, APD)或單光子雪崩光電二極管[20](single-photon avalanche photo diode,SPAD)、 多 像 素 光 子 計(jì) 數(shù) 器[21](multi-pixel photon counter, MPPC)和混合探測(cè)器等. 得益于二次發(fā)射倍增系統(tǒng), 光電倍增管具有較大的探測(cè)范圍以及較快的響應(yīng)速度, 但是其在可見(jiàn)光范圍的量子效率偏低, 所以對(duì)于微弱熒光信號(hào)的探測(cè)能力較差. 雪崩光電二極管基于二極管的雪崩倍增效應(yīng),具有極高的量子效率, 但是其動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍不如光電倍增管. 多像素光子計(jì)數(shù)器則是在雪崩光電二極管的基礎(chǔ)上, 將APD 以像素的方式集成到1 mm2的基底上, 進(jìn)一步提升了弱光探測(cè)能力. 混合光探測(cè)器則是結(jié)合了PMT 與APD 的優(yōu)點(diǎn), 不僅具有高的量子效率, 較大的動(dòng)態(tài)范圍, 低的背景噪聲和快速的時(shí)間響應(yīng), 而且還具有較大的探測(cè)范圍, 是目前STED 商用系統(tǒng)最常用的探測(cè)器. 探測(cè)器接收到熒光信號(hào)之后, 需要利用數(shù)據(jù)采集卡(data acquisition card, DAQ)來(lái)對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行收集和處理.

另外, STED 系統(tǒng)通常還會(huì)配置一個(gè)并行探測(cè)系統(tǒng), 如CCD 或互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體(complementary metal oxide semiconductor, CMOS)等對(duì)光路進(jìn)行重合和校準(zhǔn).

3.5 STED 成像系統(tǒng)

最常見(jiàn)的STED 成像系統(tǒng)一般為單光子激發(fā)、單色STED 系統(tǒng), 這種系統(tǒng)由一個(gè)激發(fā)光和一個(gè)STED 光組成, 下面將介紹近年來(lái)在單色STED系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的其他STED 成像系統(tǒng).

3.5.1 雙光子激發(fā)STED 系統(tǒng)

與單光子激發(fā)相比, 雙光子激發(fā)(two-photon excitation, TPE)具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn): 1)雙光子激發(fā)使用近紅外波長(zhǎng)的激光作為光源, 對(duì)樣品的穿透深度比短波長(zhǎng)的光更深; 2)長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光對(duì)細(xì)胞毒性較低; 3)雙光子只在物鏡的焦點(diǎn)處激發(fā), 因此雙光子顯微不需要共焦針孔, 提高了熒光的檢測(cè)效率; 4)雙光子激發(fā)只在焦平面上有光漂白, 適合用來(lái)觀察厚樣本和活細(xì)胞, 或用來(lái)進(jìn)行定點(diǎn)光漂白實(shí)驗(yàn)[22,23].

將TPE 和STED 結(jié)合(圖12), 使用1060 nm的脈沖激發(fā)光源對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行雙光子激發(fā), 使用676 nm 的連續(xù)光作為STED 光, 充分發(fā)揮了TPE和STED 的優(yōu)勢(shì)[24].

Bianchini 等[25]報(bào)道了基于單個(gè)光源的雙光子STED 成像方案(SW2PE-STED), 該系統(tǒng)利用770 nm 的飛秒激光同時(shí)實(shí)現(xiàn)了激發(fā)與受激輻射.需要注意的是, 雙光子激發(fā)光與STED 光的脈沖寬度必須相差大約三個(gè)數(shù)量級(jí), 并且強(qiáng)度必須相差兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上. 因此, 需要通過(guò)PBS 實(shí)現(xiàn)對(duì)單色光源的能量分配, 并對(duì)STED 光束的脈沖寬度進(jìn)行擴(kuò)展(圖13). 該系統(tǒng)能夠在2PE 成像的基礎(chǔ)上將空間分辨率提升4—5 倍. 目前該系統(tǒng)方案僅對(duì)于ATTO647 N 這種常見(jiàn)的熒光染料進(jìn)行了驗(yàn)證,其他種類(lèi)的熒光染料尚未得到驗(yàn)證.

3.5.2 雙色STED 系統(tǒng)

生物樣品的結(jié)構(gòu)和功能非常豐富, 對(duì)多種結(jié)構(gòu)同時(shí)成像的需求日益迫切, 通過(guò)增加一路激發(fā)光與一路STED 光, 可以實(shí)現(xiàn)雙色STED 成像系統(tǒng). 最早的雙色STED 系統(tǒng)利用四個(gè)單波長(zhǎng)的激光器來(lái)實(shí)現(xiàn)雙色STED 成像[26], 這種方法雖然直接有效,但是系統(tǒng)復(fù)雜, 成本很高.

對(duì)于激發(fā)波長(zhǎng)相近的兩種熒光染料, 可以考慮使用同一個(gè)波長(zhǎng)的STED 光進(jìn)行擦除. 2013年,G?ttfert 等針對(duì)ATTO594 和KK114 兩種染料,搭建了一套簡(jiǎn)易的雙色STED 系統(tǒng)[27]. 分別用595 和640 nm 兩個(gè)通道的激發(fā)光進(jìn)行激發(fā), 并使用20 MHz, 脈沖帶寬1.2 ns 的775 nm 脈沖光對(duì)兩個(gè)通道同時(shí)擦除. 由于兩種染料的發(fā)射波長(zhǎng)分別為620 和670 nm, 因此利用雙色鏡可以很容易地將熒光信號(hào)分離到兩個(gè)通道進(jìn)行探測(cè). 這種雙色STED 系統(tǒng)不僅結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 而且具有較好的共定位效果, 但是在染料類(lèi)型的選擇上仍受到限制.

圖12 雙光子STED 系統(tǒng)示意圖[24]Fig. 12. Schematic diagram of two-photon STED system[24].

圖13 雙光子STED 系統(tǒng)及成像結(jié)果[25] (a) SW2PE-STED 系統(tǒng)示意圖; (b) 2PE 與2PE-STED 成像對(duì)比Fig. 13. Schematic of two-photon STED and imaging results[25]: (a) Schematic of SW2PE-STED system; (b) 2PE and 2PE-STED imaging.

相比于在系統(tǒng)中采用四個(gè)或者三個(gè)激光器來(lái)實(shí)現(xiàn)雙色STED 成像, 通過(guò)選取同一激發(fā)波長(zhǎng), 不同發(fā)射波長(zhǎng), 且可用同一個(gè)STED 光進(jìn)行擦除的兩種染料如黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)和綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP), 利用熒光發(fā)射波長(zhǎng)的不同, 使用雙色鏡把兩路熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi), 從而達(dá)到只用一個(gè)激發(fā)光和一個(gè)STED 光, 實(shí)現(xiàn)雙色成像的目的[28].T?nnesen 等[28]在2011年提出的這種雙色STED成像方法(圖14(a))利用了兩種具有不同發(fā)射波長(zhǎng)的染料(圖14(b)), 該方法大大簡(jiǎn)化了雙色STED 系統(tǒng)的復(fù)雜性, 實(shí)現(xiàn)了橫向分辨率為80 nm 的雙色活體突觸成像. 但是, 這種方法只對(duì)特殊的染料有作用, 所以其應(yīng)用受到很大限制.

圖14 雙光源雙色STED 系統(tǒng)示意圖[28] (a)雙光源雙色STED 系統(tǒng)示意圖; (b) YFP 與GFP 的熒光發(fā)射光譜Fig. 14. Schematic diagram of two laser source dual-color STED system[28]: (a) Dual-color STED system with two laser sources;(b) emission spectra of GFP and YFP.

3.5.3 多壽命多色STED 系統(tǒng)

Bückers 等[29]于2011年提出了一種四光源多壽命多色STED 成像方法. 與雙光源雙色STED系統(tǒng)類(lèi)似, 這種方法使用具有幾乎相同的吸收和發(fā)射光譜但熒光壽命不同的兩種熒光染料, 用共同的激發(fā)光和STED 光來(lái)對(duì)兩種熒光染料進(jìn)行STED成像, 并通過(guò)它們熒光壽命的不同來(lái)進(jìn)行信號(hào)的分離. 第三個(gè)通道則用另外的激發(fā)光與STED 光進(jìn)行成像, 通過(guò)熒光發(fā)射波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行區(qū)分. 由于第一、第二通道不需要第二個(gè)STED 光, 壽命分離對(duì)漂移不敏感, 因此比較適合共定位分析. 這種基于壽命分離的方法雖然使多色系統(tǒng)得到簡(jiǎn)化, 但卻同樣在熒光染料上受到限制.

3.5.4 三維STED 成像

隨著生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展, 對(duì)樣品的三維觀察越發(fā)重要. 目前實(shí)現(xiàn)3D-STED 超分辨成像的方法主要有波前非相干調(diào)節(jié)、4π 法以及結(jié)構(gòu)光照明法.

通過(guò)圖15 所示的0/π(左下PM1)和0—2 π螺旋相位板(左下PM2)對(duì)兩束光進(jìn)行空間調(diào)制時(shí), 可以產(chǎn)生橫向及縱向的中空環(huán)形光束. 將所產(chǎn)生的兩束非相干光重合, 可以得到三維中空的STED 光, 在橫向及縱向壓縮激發(fā)光斑的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSF). 利用三維光斑在樣品上進(jìn)行三維掃描, 就可以通過(guò)后期重構(gòu)得到樣品的三維STED圖像[30]. 這種實(shí)現(xiàn)3D-STED 成像的方法比較簡(jiǎn)單, 但缺點(diǎn)是橫向與軸向分辨率通常相差50 nm以上, 3D 成像質(zhì)量較差.

除了以上對(duì)兩束STED 光的波前進(jìn)行調(diào)制外,第二種方法是基于4π 顯微鏡實(shí)現(xiàn)三維超分辨成像. 4π 顯微鏡是通過(guò)增加物鏡的接收角(等效于增加物鏡NA)來(lái)使空間立體角達(dá)到4π, 從而大幅度減小PSF, 提高軸向分辨率[31]. 利用4π 方法實(shí)現(xiàn)3D-STED 超分辨成像, 需要在樣品兩端放置兩個(gè)相同的物鏡, 在樣品兩端同時(shí)照明并接收熒光信號(hào), 系統(tǒng)中的兩束STED 光只有一束通過(guò)相位板調(diào)制成環(huán)形光. 通過(guò)調(diào)節(jié)兩束STED 光以相同或相差180°的偏振方向分別從兩個(gè)物鏡入射, 在樣品上發(fā)生相長(zhǎng)干涉(橫向環(huán)形斑)或相消干涉(縱向環(huán)形斑), 兩種光斑通過(guò)光強(qiáng)非相干疊加就可以產(chǎn)生三維的空心球形光斑, 從而實(shí)現(xiàn)3D-STED 成像(圖16)[32]. 利用這種方法, 可以成倍地提升光學(xué)系統(tǒng)的軸向分辨率, 將軸向分辨率從500 nm 提升到約40 nm, 在三維成像上有明顯的優(yōu)勢(shì). 但是,4π 方法需要用到兩個(gè)物鏡, 而且對(duì)光路的對(duì)準(zhǔn)要求非常嚴(yán)苛, 使其應(yīng)用受到了很大的限制. 2016年北京大學(xué)Yang 等[33]通過(guò)在樣品后方放置一面介質(zhì)反射鏡來(lái)使入射光與反射光在樣品焦面發(fā)生干涉, 能夠在一定程度上降低系統(tǒng)的復(fù)雜性.

Gustafsson 等[34,35]和Xue 等[36]提出使用結(jié)構(gòu)光照明可以實(shí)現(xiàn)三維成像. 具體方法是, 利用線性相位光柵產(chǎn)生–1, 0, +1 三級(jí)衍射光, 衍射光經(jīng)過(guò)物鏡聚焦后在樣品的焦平面處發(fā)生干涉, 并產(chǎn)生具有橫向和軸向結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度分布(圖17(a)).

圖15 基于非相干波前調(diào)制的3D-STED 成像系統(tǒng)示意圖[30]. 插圖: 用于實(shí)現(xiàn)橫向超分辨(HR)或3D 超分辨率(3D)的相位板及對(duì)應(yīng)的STED PSFFig. 15. Schematic diagram of 3D-STED system with non-coherent wavefront modulation[30]. Inset: combinations of phase plates and resulting STED PSFs used to achieve either ultimate lateral resolution (HR) or 3D superresolution.

圖16 利用4π 法實(shí)現(xiàn)3D-STED 成像的系統(tǒng)示意圖[32]Fig. 16. Schematic diagram of 4π3D-STED system[32].

圖17 基于結(jié)構(gòu)光照明的系統(tǒng)圖[35,36] (a)結(jié)構(gòu)光照明系統(tǒng)圖及空間強(qiáng)度分布; (b)結(jié)構(gòu)光照明3D-STED 系統(tǒng)示意圖Fig. 17. Structured illumination system[35,36]: (a) Simplified diagram of the structured illumination apparatus and spatial intensity distribution; (b) structured illumination 3D-STED system.

利用這種結(jié)構(gòu)光照明的原理, Xue 和So[36]進(jìn)一步利用衍射光學(xué)元件(diffractive optical elements, DOE)將衍射光擴(kuò)展到五束(圖17(b)),搭建了基于結(jié)構(gòu)光的3D-STED 系統(tǒng). 在DOE 的傅里葉面, 每個(gè)光束的相位由SLM 調(diào)制, 可以使圖像平面中的干涉圖案發(fā)生位移. 改變中心光束和周邊光束之間的相對(duì)強(qiáng)度可以改變干涉圖案的對(duì)比度. 利用五束衍射光干涉來(lái)產(chǎn)生3D 網(wǎng)格, 能夠獲得對(duì)稱(chēng)的徑向超分辨成像. 此外, Xue 等[37]在2011年也提出了對(duì)徑向偏振光或切向偏振光進(jìn)行相位調(diào)制, 實(shí)現(xiàn)相干與非相干疊加的方法來(lái)產(chǎn)生三維空心光斑.

4 低功率STED 超分辨成像技術(shù)

對(duì)STED 成像系統(tǒng)所做的各種改進(jìn), 需要實(shí)現(xiàn)的一個(gè)非常重要的目標(biāo)是對(duì)活體生物樣品成像.在STED 系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用中, 主要受限于STED光帶來(lái)的光損傷. STED 系統(tǒng)的分辨率與STED光的強(qiáng)度成正比, 理論上通過(guò)提高STED 光的功率可以使熒光光斑的面積無(wú)限小. 然而當(dāng)STED光的強(qiáng)度增強(qiáng)時(shí), 一方面會(huì)加劇熒光染料的光漂白, 另一方面也會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生光損傷. 所以, STED系統(tǒng)目前一個(gè)重要的發(fā)展方向, 就是在保持分辨率優(yōu)勢(shì)的前提下, 降低STED 光的能量, 減小對(duì)樣品的光損傷. 另一方面, STED 光學(xué)系統(tǒng)一般都存在像差, 而厚的生物樣品通常會(huì)產(chǎn)生更復(fù)雜的像差[38],從而使STED 光的波前發(fā)生畸變, 降低擦除效率.在光路中使用一個(gè)或多個(gè)自適應(yīng)光學(xué)元件如SLM,可以有效補(bǔ)償系統(tǒng)和樣品引起的像差, 在相同的STED 光功率下提高成像質(zhì)量和系統(tǒng)的空間分辨率[39,40].

4.1時(shí)間門(mén)控STED 技術(shù)

熒光分子被激光激發(fā), 吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài), 再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)自發(fā)輻射熒光回到基態(tài), 這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為自發(fā)輻射. 在自發(fā)輻射熒光的過(guò)程中, 熒光強(qiáng)度降低到初始強(qiáng)度的1/e時(shí)所需要的時(shí)間, 稱(chēng)為熒光壽命, 常用tfl表示. 也可以理解為熒光壽命是熒光分子被激發(fā)后回到基態(tài)之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間. 前文提到, 熒光衰減率Kfl= 1/tfl, 相反地,tfl也可以由Kfl表示:

由于STED 系統(tǒng)中的STED 光能夠使處于激發(fā)態(tài)的分子發(fā)生受激輻射躍遷回到基態(tài), 相當(dāng)于縮短了受到STED 光照射的熒光分子的熒光壽命, 即

式中KSTED為受激輻射速率.

(6)式表明, 由于受激輻射的存在, 使得熒光分子的熒光壽命變短, 這為利用壽命信息提高系統(tǒng)分辨率提供了可能.

STED 成像時(shí), 激發(fā)光照射的區(qū)域產(chǎn)生了熒光壽命較長(zhǎng)的光子, 而激發(fā)光與STED 光重疊的區(qū)域由于發(fā)生了受激輻射效應(yīng), 所以該區(qū)域所發(fā)射熒光的壽命會(huì)明顯減少.時(shí)間門(mén)控STED 技術(shù)[41,42]利用不同區(qū)域熒光壽命不同的特性, 在激發(fā)光照射到樣品一定時(shí)間Tg后才開(kāi)始收集光子, 過(guò)濾掉短壽命的光子, 只接收來(lái)自激發(fā)中心的長(zhǎng)壽命光子,能夠有效提升STED 系統(tǒng)的空間分辨率(圖18(a)).利用時(shí)間門(mén)控來(lái)進(jìn)行篩選, 需要將光源與探測(cè)單元進(jìn)行時(shí)間同步調(diào)節(jié), 并且搭配可以快速開(kāi)啟和關(guān)閉的光子探測(cè)器(如SPAD).

理論上通過(guò)延遲門(mén)控SPAD 的開(kāi)啟時(shí)間能夠持續(xù)提升系統(tǒng)的空間分辨率. 然而, 由于STED 系統(tǒng)的STED 光通常無(wú)法實(shí)現(xiàn)中心的絕對(duì)零強(qiáng)度,所以即使是處于激發(fā)光中心的光子也有可能受到STED 光的影響而縮短壽命, 延遲門(mén)控SPAD 的開(kāi)啟時(shí)間在濾除受激輻射區(qū)域光子的同時(shí)也會(huì)濾除一部分自發(fā)輻射區(qū)域的光子, 使接收到的長(zhǎng)壽命的光子數(shù)減少. 因此, 延遲門(mén)控SPAD 開(kāi)啟時(shí)間在提升分辨率的同時(shí)也會(huì)使系統(tǒng)的信噪比(signalnoise ratio, SNR)降低, 需要根據(jù)系統(tǒng)的實(shí)際情況來(lái)調(diào)節(jié)門(mén)控的開(kāi)啟時(shí)間. 此外, 可通過(guò)多圖像反卷積來(lái)減少時(shí)間門(mén)控STED 系統(tǒng)對(duì)SNR 的影響[43].Diaspro 等[41]選擇在激發(fā)光到達(dá)樣品2 ns 后開(kāi)啟時(shí)間門(mén),時(shí)間門(mén)長(zhǎng)度為7 ns, 可以排除反斯托克斯光, 最終在50 mW 的STED 光功率下實(shí)現(xiàn)75 nm的分辨率, 而Giuseppe 等[42]則在250 mW 的功率下實(shí)現(xiàn)35 nm 的分辨率.

4.2 離線門(mén)控STED 技術(shù)

使用時(shí)間門(mén)控來(lái)控制探測(cè)器接收信號(hào)的時(shí)間,雖然能夠在一定程度上提升STED 成像的分辨率,然而對(duì)于不同的系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 在分辨率和峰值信 噪 比(peak signal-to-noise ratios, PSNR)上,Tg的選擇則沒(méi)有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn).

浙江大學(xué)Wang 等[44]提出了離線時(shí)間選通來(lái)實(shí)現(xiàn)時(shí)間門(mén)控STED 的方法, 將STED 系統(tǒng)的分辨 率 從75 nm 提 高 到38 nm, 同時(shí) 降 低 了 所 需STED 光的功率(圖19). 這種方法采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(time-correlated single-photon counting,TCSPC)技術(shù), 記錄所有激發(fā)脈沖和相應(yīng)的熒光光子之間的時(shí)間間隔并統(tǒng)計(jì)為直方圖. 這種離線時(shí)間門(mén)控方法允許實(shí)驗(yàn)人員在后期自由選擇合適的時(shí)間門(mén), 以保證獲得分辨率與PSNR 之間最佳的平衡.

圖19 離線時(shí)間門(mén)控STED[44] (a)共聚焦、STED 與off-line gated-STED 分辨率結(jié)果; (b) Tg、分辨率與PSNR 關(guān)系曲線Fig. 19. Off-line gated-STED[44]: (a) Spatial resolutions of confocal, STED and off-line gated-STED; (b)the relationship between Tg,resolution and PSNR.

4.3 STED-FLIM 相圖分析技術(shù)

時(shí)間門(mén)控STED 方法通過(guò)選擇性接受長(zhǎng)壽命的光子來(lái)排除STED 光區(qū)域的光子, 雖然能一定程度提升系統(tǒng)的空間分辨率, 但同時(shí)也會(huì)排除掉許多激發(fā)光中心區(qū)域的光子, 丟失了部分信息. 將所有光子的壽命信息記錄下來(lái), 采用相圖分析法進(jìn)行分離, 能在更大程度上利用所采集到的光子信息.2018年Wang 等[45]在STED 系統(tǒng)上加入了脈沖同步單元和TCSPC 數(shù)據(jù)采集卡, 將STED 系統(tǒng)與熒光壽命成像(fluorescence lifetime imaging,FLIM)技術(shù)相結(jié)合, 建立了STED-FLIM 系統(tǒng).對(duì)STED-FLIM 系統(tǒng)所采集的圖像進(jìn)行相圖(phasor plot)分析, 實(shí)現(xiàn)了在低功率下的STED超分辨成像(圖20), 利用這種STED-FLIM 的相位圖分析法, 在不增加STED 光能量的前提下成功地將不同壽命的光子進(jìn)行分離, 分辨率從150 nm提高到80 nm.

4.4 pSTED-SPLIT 技術(shù)

在不提高STED 光功率的前提下, 光子數(shù)分離是基于相量分析法[46]的一種有效提高STED 系統(tǒng)空間分辨率的方法. 對(duì)于相位圖中壽命變化與有效熒光光子之間的關(guān)系, 目前還沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn).Tortarolo 等[47]提出了區(qū)域分割法(圖21(a))與pSTED-SPLIT 方法(圖21(b)), 提高了系統(tǒng)的空間分辨率, 同時(shí)降低了光漂白.

圖20 STED-FLIM 成像及相圖分析結(jié)果[45] (a)彩色相位圖; (b)熒光珠的共聚焦圖像; (c)熒光珠的STED 圖像(10 mW);(d)時(shí)間門(mén)STED 圖像; (e)相圖分析后的圖像Fig. 20. STED-FLIM and Phasor-plot analysis[45]: (a) Phasor color map of the STED-FLIM image; (b) Confocal, (c) STED·(10 mW), (d) time gate STED and (e) Phasor-plot images of fluorescent beads.

圖21 區(qū)域分割法與pSTED-SPLIT 方法所得到的熒光珠的成像結(jié)果[47] (a)區(qū)域分割法示意圖; (b) pSTED-SPLIT 方法示意圖;(c)從左到右依次為熒光珠的共聚焦、常規(guī)STED、區(qū)域分割法STED 和pSTED-SPLIT 的成像結(jié)果Fig. 21. Imaging results of fluorescent beads using segmentation and pSTED-SPLIT methods[47]: (a) Schematic diagram of segmentation method; (b) schematic diagram of pSTED-SPLIT method; (c) from left to right: Confocal, conventional STED, segmentation STED, and pSTED-SPLIT imaging results of fluorescence beads.

4.5 利用量子點(diǎn)作為熒光探針實(shí)現(xiàn)STED超分辨成像

在STED 成像中, 使用量子點(diǎn)作為探針可以提高探針的抗漂白和光穩(wěn)定性. 2017年北京大學(xué)Liu 等[48]首次利用上轉(zhuǎn)換納米粒子(upconversion nanoparticle, UCNP)實(shí)現(xiàn)了STED 超分辨成像,通過(guò)在UCNP 上摻雜高濃度的銩離子(Tm3+), 用980 nm 波長(zhǎng)激發(fā)UCNP 可以很容易地在其中間亞穩(wěn)態(tài)3H4能級(jí)上建立粒子數(shù)反轉(zhuǎn), 使用808 nm激光照射, 匹配3H4→3H6躍遷的上轉(zhuǎn)換帶, 可以觸發(fā)放大的受激輻射以釋放3H4中間能級(jí), 從而可以抑制上轉(zhuǎn)換路徑(圖22). 利用上轉(zhuǎn)換發(fā)光, 用980 nm 激光激發(fā)熒光, 808 nm 激光作為STED光可以有效提高受激輻射效率, 降低STED 光強(qiáng)度, 減少對(duì)生物樣品的光損傷. 利用這種方法,可以將STED 光飽和強(qiáng)度降低兩個(gè)數(shù)量級(jí)(0.19 mW/cm2), 實(shí)現(xiàn)橫向28 nm 的分辨率(圖22(b)).幾乎同時(shí), 華南師范大學(xué)Zhan 等[49]利用UCNP在生物樣品上實(shí)現(xiàn)了STED 超分辨成像.

圖22 上轉(zhuǎn)換示意圖及利用上轉(zhuǎn)換納米顆粒的成像結(jié)果[48] (a)上轉(zhuǎn)換能級(jí)關(guān)系圖; (b)上轉(zhuǎn)換納米顆粒成像結(jié)果Fig. 22. Schematic diagram of upconversion and imaging results[48]: (a) Diagram of energy levels of upconversion nanoparticles;(b) imaging results of UCNPs.

除了UCNP 外, 還有很多其他量子點(diǎn)可以作為STED 探針. 2017年浙江大學(xué)Li 等[50]首次利用AIE 納米顆粒實(shí)現(xiàn)了STED 超分辨成像;2018年Ye 等[51]首次利用鈣鈦礦量子點(diǎn)作為STED探針實(shí)現(xiàn)了20.6 nm 的超高分辨率; 2019年Li 等[52]利用對(duì)生物體無(wú)害的碳點(diǎn)作為STED 探針, 實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)超分辨成像; 2020年, Liang 等[53]利用靶向性較好的有機(jī)硅量子點(diǎn)作為探針, 實(shí)現(xiàn)了活體STED 超分辨成像.

4.6 熒光發(fā)射差分超分辨成像

2013年浙江大學(xué)Kuang 等[54]提出了一種與STED 思想類(lèi)似的可在低功率下實(shí)現(xiàn)超分辨成像的熒光發(fā)射差分(fluorescence emission difference,FED)法. 即利用同一波長(zhǎng)的兩束激發(fā)光對(duì)樣品激發(fā), 其中一束為常規(guī)的高斯光斑, 另一束為經(jīng)過(guò)相位板調(diào)制波前的環(huán)形光斑. 高斯激發(fā)光斑(圖23(a))在探測(cè)器上的最終PSFc為高斯激發(fā)光斑與小孔PSF 卷積的結(jié)果(圖23(c)), 此時(shí)得到的是共聚焦圖像; 環(huán)形激發(fā)光斑(圖23(b))在探測(cè)器上的最終PSFn為環(huán)形激發(fā)光斑與小孔PSF 卷積的結(jié)果(圖23(d)), 此時(shí)得到的是負(fù)共聚焦圖像.

用共聚焦圖像減去負(fù)共聚焦圖像就可以得到超分辨的FED 圖像, 最終的PFSFED為

成像結(jié)果為

式中Ic,In和IFED分別為共聚焦、負(fù)共聚焦和FED 圖像的歸一化強(qiáng)度分布, 而r是減法因子.

FED 方法可以避開(kāi)STED 需要高強(qiáng)度STED 光的劣勢(shì), 僅在激發(fā)光功率水平, 就能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)相距105 nm 的熒光珠的超分辨成像. 在熒光飽和的情況下, 通過(guò)調(diào)整減法因子r, 可以獲得高質(zhì)量的超分辨圖像.

4.7 數(shù)字增強(qiáng)型STED 超分辨成像

受FED 超分辨成像方法的啟發(fā), 最近我們課題組, 開(kāi)發(fā)了一種新型STED 圖像處理方法, 即數(shù)字增強(qiáng)型STED(DE-STED), 該方法可大大降低STED 光所需功率, 使活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間超分辨成像成為可能[55]. 圖24 為DE-STED 的基本原理, 用共聚焦強(qiáng)度圖減去STED 強(qiáng)度圖, 即可得到STED光由于受激輻射效應(yīng)擦除掉的光子強(qiáng)度圖(圖24(c)中的Donut 圖), 由于受激輻射效率在低STED 光功率情況下是很低的, 用STED 強(qiáng)度圖減去N倍的Donut 圖, 即可實(shí)現(xiàn)重疊區(qū)域的受激輻射效率100%(理想STED 成像是STED 光與激發(fā)光重疊區(qū)域的受激輻射效率為100%), 在傳統(tǒng)的STED超分辨成像中需要非常高的STED 光才可以實(shí)現(xiàn)100%的受激輻射效率. 因此, DE-STED 可以在較低的STED 光功率下實(shí)現(xiàn)非常高的分辨率.

圖23 FED 成像原理[53]Fig. 23. Illustration of FED theory[53].

圖24 DE-STED 原理圖[55]Fig. 24. Schematic principle of DE-STED[55].

4.8 基于自適應(yīng)光學(xué)的STED 超分辨成像

在進(jìn)行深層生物樣品STED 超分辨成像時(shí),常會(huì)由于樣品內(nèi)部的折射率分布不均勻引入嚴(yán)重的像差, 導(dǎo)致STED 成像效果較差, 即便是很強(qiáng)的STED 光都很難實(shí)現(xiàn)超分辨成像. 最有效的解決辦法是引入自適應(yīng)光像差校正技術(shù), 常用的像差校正算法為澤尼克多項(xiàng)式[39]. 2017年Yan 等[38]首次將 相 干 自 適 應(yīng) 光 學(xué)(coherent optical adaptive techniques, COAT)技術(shù)引入STED, 極大地提高了STED 的成像深度以及樣品成像的空間分辨率.2019年, Wang 等[40]發(fā)展了基于遺傳算法的STED(GA-STED)成像技術(shù), 提高了成像速度和精度,實(shí)現(xiàn)了快速實(shí)時(shí)像差校正的STED 成像. 引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)后和之前相比, 在保持相同分辨率的情況下, 有效地降低了STED 光能量.

5 STED 系統(tǒng)與其他技術(shù)的組合

將STED 與其他成像系統(tǒng)結(jié)合, 可以提高或者擴(kuò)展系統(tǒng)的成像能力.

5.1 STED 與FCS 的結(jié)合

熒 光 相 關(guān) 光 譜 (fluorescence correlation spectroscopy, FCS)技術(shù)是一種能夠通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度的變化來(lái)獲取溶液的濃度、粒子擴(kuò)散系數(shù)等信息的單分子水平檢測(cè)技術(shù), 對(duì)于探究活細(xì)胞內(nèi)的生物過(guò)程具有重要的意義[56?58]. Lanzanò等[58]最早于2005年提出將STED 與FCS 相結(jié)合. 2011年Gould 等[59]為了在宏觀分子尺度上對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行成像和光譜分析, 將全內(nèi)反射熒光(total internal reflection fluorescence, TIRF)顯微與STED 結(jié)合進(jìn)行熒光光譜分析圖25. 一方面,由于TIRF 可以減小測(cè)量體積的軸向范圍, 另一方面, STED 又能提升系統(tǒng)的成像能力, 所以將TRIF與STED 結(jié)合可以克服STED 系統(tǒng)受到離焦信號(hào)影響及全內(nèi)發(fā)射顯微系統(tǒng)分辨力低的缺點(diǎn). TIRFSTED-FCS 系統(tǒng)的關(guān)鍵是要調(diào)節(jié)激發(fā)光與STED光的偏振態(tài), 確保激發(fā)光為切向偏振態(tài), STED 光為圓偏振態(tài), 以獲得激發(fā)焦點(diǎn)的偏振和STED 焦點(diǎn)之間的最佳匹配[60].

圖25 TIRF-STED-FCS 系統(tǒng)示意圖[59]Fig. 25. Schematic of TIRF-STED-FCS system[59].

2014年Honigmann 等[61]把掃描STED 技術(shù)與FCS 相 結(jié) 合(scanning STED-FCS, sSTEDFCS), 能夠利用STED 技術(shù)提供的超高空間分辨率和FCS 技術(shù)帶來(lái)的快速時(shí)間分辨對(duì)細(xì)胞內(nèi)分子的納米級(jí)活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)(圖26), 對(duì)于解決真核質(zhì)膜中脂質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用具有重要意義.

圖26 脂膜上sSTED-FCS 的成像結(jié)果[61]Fig. 26. sSTED-FCS results of the lipid membrane[61].

5.2 STED 與細(xì)胞膨脹技術(shù)的結(jié)合

膨脹顯微[62](expansion microscopy, ExM)通過(guò)在樣品內(nèi)直接合成可溶脹的聚電解質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò), 然后在水中透析樣品, 可以使樣品發(fā)生各向同性的膨脹, 相當(dāng)于物理上將樣品結(jié)構(gòu)進(jìn)行擴(kuò)大(約4.5 倍), 從而可以用普通顯微鏡觀察到小于衍射極限的結(jié)構(gòu). 原則上膨脹顯微技術(shù)可以和現(xiàn)有的超分辨成像技術(shù)進(jìn)行結(jié)合, 然而由于成像體積的增大要求深度的聚焦, 且單分子定位顯微等技術(shù)需要的特殊緩沖液可能會(huì)干擾凝膠的擴(kuò)增, 而STED 基于共聚焦原理, 對(duì)樣品的深度成像相對(duì)簡(jiǎn)單, 而且無(wú)需任何特殊緩沖液, 所以將ExM 與STED 相結(jié)合是比較合理的方案. 將ExM 與STED 相結(jié)合形成ExSTED, 在樣品膨脹四倍后進(jìn)行STED 成像, 能夠?qū)崿F(xiàn)2 D 成像的有效空間分辨率小于10 nm,3D 成像的有效空間分辨率小于50—70 nm[63].

5.3 STED 與掃描離子電導(dǎo)顯微鏡的結(jié)合

掃描離子電導(dǎo)顯微鏡(scanning ion-conductance microscope, SICM)是掃描電鏡中少數(shù)可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行成像的顯微鏡, 通過(guò)對(duì)樣品表面電解質(zhì)的局部離子電流進(jìn)行采樣, 可以獲得樣品的表面輪廓[64]. 早在2002年就已實(shí)現(xiàn)了將SICM 和Confocal的結(jié)合[65], 因此, 理論上將SICM 與STED 結(jié)合是可行的. Hagemann 等[66]對(duì)同一樣品進(jìn)行了SICM 與STED 成像, 兩種成像結(jié)果將微管蛋白網(wǎng)絡(luò)的變化與細(xì)胞形狀和細(xì)胞形貌的變化聯(lián)系起來(lái),對(duì)于研究細(xì)胞膜粗糙度、細(xì)胞形狀和高度與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系有重要意義.

5.4 STED 與PALM/STROM 的結(jié)合

MINFLUX 方法是2018年提出的一種結(jié)合了光束波前調(diào)制與單分子定位[67,68]的新的超分辨成像技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了約1.5 nm 的單分子定位精度[69,70].具體來(lái)說(shuō), MINFLUX 技術(shù)通過(guò)相位掩模版對(duì)激光波前進(jìn)行調(diào)制, 使光束在物鏡處產(chǎn)生環(huán)形激發(fā)光.與STED 技術(shù)不同的是, 該環(huán)形光束是用來(lái)激發(fā)而不是抑制熒光的產(chǎn)生. 然后, 與單分子定位顯微技術(shù), 如光激活定位顯微 (photo-activated localization microscopy, PALM)或隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微(stochastic optical reconstruction microscopy,STROM)技術(shù)類(lèi)似, 通過(guò)控制隨機(jī)地開(kāi)啟或關(guān)閉單個(gè)分子, 當(dāng)目標(biāo)分子位于光斑的圓環(huán)上時(shí), 分子將發(fā)射熒光; 當(dāng)目標(biāo)分子位于光斑的圓環(huán)中心即暗點(diǎn)時(shí)則不會(huì)發(fā)射熒光. 通過(guò)探測(cè)目標(biāo)分子發(fā)出的光子, 控制光束偏轉(zhuǎn)器使目標(biāo)分子始終位于環(huán)形光的中心. 利用這種方法, 就可以精確地定位出光子的位置. MINFLUX 顯微方法與STED 相比, 避免了光學(xué)元器件對(duì)于光斑的影響, 通過(guò)光子狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)超分辨成像. 與PALM/STROM 方法相比, 分子定位不再依賴(lài)于分子自身的熒光光子, 而是利用環(huán)形激發(fā)光束提供大量的光子來(lái)實(shí)現(xiàn)定位. 這樣一來(lái), 可以提高對(duì)光子的利用率, 能夠?qū)Ψ肿舆M(jìn)行快速追蹤, 同時(shí)也提高了定位精度.

此外, STED 與其他技術(shù)如X 射線掃描衍射[71]、原 子 力 顯 微 鏡[72,73](atomic force microscope,AFM)等相結(jié)合, 可以提升成像性能, 對(duì)于探究生物樣品內(nèi)不同結(jié)構(gòu)間的聯(lián)系具有重要的意義.

6 STED 在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

STED 技術(shù)發(fā)展的早期多用于對(duì)納米熒光珠、熒光標(biāo)記的生物樣品等進(jìn)行成像. 但是隨著STED 技術(shù)的不斷發(fā)展, 實(shí)現(xiàn)超分辨成像所需的光功率大大降低, 使得STED 也能實(shí)現(xiàn)對(duì)活體生物樣品如小鼠大腦組織和細(xì)胞[74,75]、樹(shù)突棘細(xì)胞[76]等進(jìn)行超分辨成像, 從而在神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用. 另外, STED 也與FCS 技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞內(nèi)分子運(yùn)動(dòng)的研究, 為STED 技術(shù)探究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)提供了可能[61].

7 總結(jié)與討論

STED 是近年來(lái)最有發(fā)展?jié)摿Φ某直娉上穹椒ㄖ? 在分辨率及成像速率上有很大的優(yōu)勢(shì).然而, STED 技術(shù)仍然存在許多限制, 如系統(tǒng)比較復(fù)雜, 特別對(duì)于雙色或多色STED 系統(tǒng)而言, 系統(tǒng)價(jià)格昂貴也限制了其應(yīng)用; 另一方面, STED 系統(tǒng)的STED 光功率通常會(huì)較高, 會(huì)造成熒光探針的光漂白和光淬滅, 對(duì)于生物樣品也會(huì)產(chǎn)生光損傷.這些因素都限制了STED 技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的推廣和應(yīng)用. 針對(duì)這些問(wèn)題, 本文介紹了通過(guò)提高掃描成像速度來(lái)降低STED 光能量, 利用量子點(diǎn)作為探針來(lái)降低STED 光功率所造成的光漂白與光損傷. 還介紹了可以將STED 與其他顯微技術(shù)相結(jié)合, 從而在一個(gè)系統(tǒng)中利用多種技術(shù)的優(yōu)勢(shì),提高系統(tǒng)的成像性能. 此外, 還介紹了雙色及多色STED、三維STED 成像的發(fā)展.

目前STED 最主要的問(wèn)題依然是STED 光功率過(guò)高. 因此, 未來(lái)STED 技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向是在保證STED 成像速度和空間分辨率優(yōu)勢(shì)的前提下, 進(jìn)一步降低STED 光的功率, 實(shí)現(xiàn)低光照功率STED 超分辨成像; 同時(shí), 發(fā)展低毒性甚至無(wú)毒性、靶向性好和光穩(wěn)定性強(qiáng)的熒光探針. 此外,光毒性與成像深度和光波長(zhǎng)都有著密切關(guān)系, 因此未來(lái)應(yīng)傾向于用紅外光及其相應(yīng)的探針而非可見(jiàn)光來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞成像.

總的來(lái)說(shuō), STED 技術(shù)發(fā)展非常迅速, 前面所提到的一些問(wèn)題都在逐漸被解決, STED 超分辨成像未來(lái)有著巨大的發(fā)展?jié)摿εc空間.