何首烏、虎杖、大黃水提物中游離蒽醌含量的測定及對人正常肝細胞的毒性作用

王呈諭，劉曉璇，李軼群，李登科，孫震曉*

(北京中醫藥大學生命科學學院，北京 102488)

何首烏(Polygoni Multiflori Radix)、虎杖(Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix)、大黃(Rhei Radix et Rhizoma)為臨床常用中藥[1]，近年來其在臨床及動物試驗中多有致肝損傷報道，如何首烏與制何首烏及二者相關制劑可引起患者肝損害[2]，臨床調研發現含虎杖復方制劑可致肝功能異常[3]，動物實驗表明大黃可致老年大鼠肝細胞壞死及輕度膽道增生[4]。前期研究表明，何首烏和大黃的肝毒性可能與其含有的游離蒽醌(如大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚等)有關[5-6]。3種中藥均含游離蒽醌，雖然所含游離蒽醌種類及含量不同，但游離蒽醌在體內可以相互轉化[7]，因而比較3種藥材游離蒽醌含量與其肝細胞毒性的關系可為闡明3種中藥可能的肝毒性物質基礎及機制提供思路。

游離蒽醌含量測定常采用高效液相色譜色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]。HepaRG細胞為人正常肝祖細胞，分離于慢性丙肝患者肝組織，可在體外長期繼代培養，一定條件下能分化為明顯的肝細胞形態和膽管樣結構，能表達正常肝細胞相關的Ⅰ相和Ⅱ相藥物代謝酶，如CYP450及UGT1A1等，是體外研究藥物肝毒性的良好工具[9-11]。本研究主要通過比較3種中藥水提物中游離蒽醌含量及其對人正常肝細胞的毒性作用探究游離蒽醌與3種中藥肝細胞毒性的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

實驗用何首烏(產地湖北，批號01106600)、大黃(產地甘肅，批號401004095)、虎杖(產地浙江，批號401004461)飲片均購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責任公司，經北京中醫藥大學中藥學院劉春生教授鑒定，均為正品。大黃素(批號wkq16071004)、大黃素甲醚(批號wkq16070403)、蘆薈大黃素(批號140827)、大黃酸(批號140526)、大黃酚(批號140219)均購買于四川省維科奇生物科技有限公司(各成分HPLC檢驗含量均≥98%)。甲醇(色譜純)購自Fisher公司，液相用水來源于杭州娃哈哈集團有限公司。RPMI 1640培養基購自Gibco公司，胎牛血清購自Visual Technologies Inc，胰蛋白酶、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)購自北京拜爾迪生物科技有限公司，甲醇(分析純)、磷酸、無水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、NaHCO3、NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4等均購自北京化工廠，噻唑蘭(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)購自北京蘭博利德生物技術有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 儀器

高效液相色譜儀，購于Waters公司；ME204E/02分析天平，購于梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；EPOCH酶標儀，購于美國伯騰儀器有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，購于寧波新芝生物科技股份有限公司；A00-1-1102流式細胞儀，購于貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 細胞株

HepaRG人肝祖細胞，購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

1.4 中藥水提物的制備

稱量3種受試飲片，加入圓底燒瓶中。第1次取10倍量超純水，煎煮2 h，藥液過濾留存；第2次取8倍量超純水，煎煮1.5 h，藥液濾出后與第1次留存藥液合并。

使用大容量旋轉蒸發儀和恒溫水浴去除多余水分。放至室溫，-20℃預凍1 d，-80℃預凍1 d，置于真空冷凍干燥機進行干燥后，研磨成細粉，避光干燥保存。

1.5 溶液配制

1.5.1 HPLC供試品溶液制備 分別稱取上述何首烏水提物粉末0.203 9 g，虎杖水提物粉末0.203 1 g，大黃水提物粉末0.204 6 g，各加甲醇25 mL后稱重，超聲溶解40 min后，用甲醇補充至原始質量，以0.45μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5.2 HPLC標準品溶液制備 稱取各標準品(蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚)，加甲醇溶解定容，分別得到濃度為360、213、404、418、456μg/mL的標準品溶液。分別吸取上述標準品溶液各1.0 mL置于同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，以0.45μm濾膜過濾，制成混合標準品溶液。

1.5.3 細胞實驗藥液制備 稱取1.4中得到的受試飲片水提物粉末，加RPMI 1640完全培養基超聲溶解1 h，得濃度為6 mg/mL的水提物母液(水提物溶液濃度均以生藥計)，經0.45μm濾器過濾，再經0.22μm無菌濾器過濾后備用。細胞給藥時，以RPMI 1640完全培養基梯度稀釋水提物母液，得到濃度為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL(均以生藥計)的水提物藥液，備用。

1.6 中藥水提物中游離蒽醌含量測定

本研究采用HPLC法對3種中藥水提物中的各游離蒽醌進行含量檢測。

1.6.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL AK-C18(250×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇(A)，0.1%磷酸水溶液(B)；檢測器：UV檢測器；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：10μL；柱溫：室溫。梯度洗脫程序見表1。

1.6.2 線性關系考察 按梯度體積，各吸取上述標準品溶液5次于容量瓶中，各自加甲醇定容，搖勻，0.45μm濾膜過濾，備用。進樣10μL，記錄峰面積，以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。

1.6.3 精密度 吸取供試品溶液10μL，連續進樣6次，測定峰面積，計算各成分峰面積平均值及相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)值。

1.6.4 穩定性 吸取供試品溶液，室溫放置，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h進樣10μL，測定各成分峰面積，計算峰面積平均值及RSD值。

1.6.5 重復性 取同一批水提物粉末6份，按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液，測定各成分含量，計算各成分含量平均值及RSD值。

1.6.6 加樣回收率考察 稱取已知各成分含量的各藥材水提物6份，每份約0.1 g，分別添加各標準品溶液適量，按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液。測定各成分峰面積，計算各成分含量和各成分的加樣回收率及RSD值。

1.6.7 游離蒽醌含量測定 按照1.5.1中所述方法制備供試品溶液，單次進樣10μL，測定各游離蒽醌峰面積，按標準曲線外標法計算各游離蒽醌的含量。

1.7 細胞培養

HepaRG細胞在含10%胎牛血清，1%雙抗的RPMI 1640培養基中，于37℃、CO2體積分數為5%的條件下進行常規培養，取對數生長期細胞進行實驗。

1.8 MTT法測定細胞活力

選取處于對數生長期的HepaRG細胞，使用0.25%的胰酶消化成單個細胞，使用培養基將細胞濃度調整為3×104個/mL。將細胞接種于96孔板，每孔100 μL，置于CO2培養箱中培養24 h。將培養液去除，加入培養基或不同濃度的各種中藥水提物溶液(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL)，每組平行4孔，每孔150 μL(預實驗測定各組pH值、滲透壓均在正常范圍以內)，置于培養箱中培養48 h。棄去藥液，加入MTT工作液(0.5 mg/mL)，每孔100μL，置于培養箱中孵育4 h。棄去孵育液，每孔加入DMSO 150μL，溶解結晶，使用酶標儀在570 nm波長下檢測吸光度D(570)，計算細胞存活率。

1.9 AnnexinⅤ/PI雙染法測定細胞凋亡

選取處于對數生長期的HepaRG細胞，使用0.25%無EDTA的胰酶消化成單個細胞，使用培養基將細胞密度調整為8×104個/mL。將細胞接種于6孔板，置于培養箱中培養24 h。將培養液去除，加入培養基或不同濃度的各種中藥水提物溶液(1.5、2.0、2.5mg/mL)，每組平行3孔，每孔3 mL，置于CO2培養箱中培養48 h。收集全細胞至離心管，2 000 r/min，離心2 min；用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/min，離心2 min)；按照試劑盒說明書加入結合緩沖液500μL，重懸細胞；加入5μL AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5 μL碘化丙錠混勻；室溫條件下，避光孵育5～15 min；1 h內使用流式細胞儀檢測熒光強度。在儀器上，參考對照組散點圖，可將實驗組分為正常細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，并分別顯示各類細胞所占細胞總量的百分比。

1.10 統計學分析

實驗數據均采用SPSS 19.0統計軟件進行回歸分析，以表示。在細胞活力與凋亡程度方面，對照組和實驗組間樣本差異的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線 按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程見表2。

表1 梯度洗脫程序

表2 線性關系測定結果

2.1.2 精密度考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.67%和1.32%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.73%和2.95%；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.29%、1.72%、2.36%、1.54%和0.66%。所有RSD值均小于3.0%(n=5)，表明方法的精密度良好，符合實驗要求。

2.1.3 穩定性考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.98%和2.53%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.20%和0.97%；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.96%、1.10%、2.73%、2.87%和2.68%。所得的所有RSD值均小于3.0%(n=5)，表明供試品溶液在室溫放置24 h之內基本穩定。

2.1.4 重復性考察 何首烏中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.81%和1.29%；虎杖中大黃素和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為1.88%和1.92%，；大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積值的RSD分別為2.31%、1.42%、2.91%、2.71%和1.67%。所得RSD值均小于3.0%(n=5)，表明該方法的重復性良好，3種藥材水提物中各成分測定含量穩定。

2.1.5 加樣回收率考察 按上述進行加樣回收率的考察，結果見表3，3種藥材水提物中各游離蒽醌加樣回收率均處于95%～105%之間，RSD值均小于3.0%(n=5)，表明該方法的回收率良好。

表3 3種中藥水提物加樣回收率考察結果

2.2 何首烏、虎杖、大黃游離蒽醌含量測定

3種中藥水提物及生藥中游離蒽醌含量見表4，何首烏為0.229%，虎杖為0.545%，大黃為2.593%，各中藥水提物中5種主要游離蒽醌總含量順序：何首烏＜虎杖＜大黃。

2.3 中藥飲片水提物對體外培養HepaRG細胞活力的影響

3種中藥水提物對HepaRG細胞存活率的影響見圖1，何首烏在2.0、2.5、3.0 mg/mL濃度下表現出明顯的抑制細胞活力的作用；虎杖在1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL濃度下表現出顯著的抑制作用；大黃在所設全部濃度1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL下均表現出顯著的抑制作用，3種中藥水提物對人正常肝細胞的抑制作用均成劑量依賴性，抑制作用順序為何首烏＜虎杖＜大黃。除何首烏IC50值為3.17 mg/mL，在所設濃度范圍之外，虎杖和大黃的均在所設濃度范圍之內，分別為2.23、1.91 mg/mL。

表4 3種中藥水提物中游離蒽醌的含量

何首烏水提物各劑量組與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；虎杖水提物各劑量組與對照組比較，&&P＜0.01；大黃水提物各劑量組與對照組比較，##P＜0.01.圖1 何首烏、虎杖、大黃水提物作用HepaRG細胞48 h后的細胞存活率

2.4 中藥飲片水提物對體外培養HepaRG細胞凋亡的影響

3種中藥飲片水提物對HepaRG細胞凋亡的影響見表5，在1.5、2.0、2.5 mg/mL濃度下，何首烏水提物誘導人正常肝細胞總凋亡率分別為(2.52±0.95)%、(7.23±0.12)%、(23.36±1.91)%，虎杖水提物分別為(15.47±2.49)%、(52.91±0.37)%、(74.4±0.76)%，大黃水提物分別為(56.24±3.08)%、(82.36±0.53)%、(85.67±0.31)%，與對照組總凋亡率(0.04+0.01)%相比，3種中藥水提物均明顯誘導人正常肝細胞凋亡，各濃度下對細胞凋亡的影響大小順序為何首烏＜虎杖＜大黃。

表5 何首烏、虎杖、大黃對HepaRG細胞凋亡的影響

3 討論

本研究采用HPLC法測定了3種中藥何首烏、虎杖、大黃主要游離蒽醌大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚含量，比較了3種中藥水提物中游離蒽醌的含量，發現大黃中的游離蒽醌以大黃酚和大黃酸較高，其次為大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素，而虎杖和何首烏則僅檢測出大黃素和大黃素甲醚，整體來看，游離蒽醌的含量排序為何首烏＜虎杖＜大黃。本研究選用人正常肝祖母細胞HepaRG比較研究了3種中藥水提物體外肝細胞毒性，細胞活力及凋亡實驗均表明，3種中藥提取物的肝細胞毒性為何首烏＜虎杖＜大黃，與游離蒽醌含量順序一致，提示3種中藥游離蒽醌含量與其肝細胞毒性有一定相關性。

已有多個課題組報道過游離蒽醌對肝細胞的毒性作用。如我們課題組前期研究發現，大黃素可以誘導人肝實質L02細胞凋亡[5]。竇志華等用大黃游離蒽醌提取物灌胃大鼠獲得含藥血清(含5種原型成分、15種代謝產物)，并以不同劑量含藥血清處理HL-7702細胞，檢測其谷草轉氨酶的泄漏情況，發現大黃蒽醌類成分具有肝毒性，且游離蒽醌為效應物質之一[6]。賈歌劉暢的細胞實驗表明何首烏醇提物以及大黃素、大黃酸等對人正常肝細胞有一定的誘導凋亡作用，且大黃素的作用要強于大黃酸[12]。劉德明等使用大黃素作用于L02細胞，發現一定濃度的大黃素對L02細胞具有明顯的毒性，能夠顯著提升L02細胞內的ROS水平，激活caspase-8[13]。衛培峰等對大鼠連續3個月經口灌胃大黃素、大黃酸和大黃酚，發現大黃素、大黃酸并不能促進大鼠體內肝細胞凋亡，但大黃酚可以導致大鼠肝細胞凋亡[14]。任璐等對大鼠連續14 d經口灌胃給藥大黃素甲醚，未見明顯的與大黃素甲醚有關的肝毒性[15]。上述研究表明，游離蒽醌有肝細胞毒性，但是各個單體的貢獻及在體內的實際作用還需要進一步研究闡明。汪美汐等使用大黃素處理L02細胞，通過測定細胞活力、細胞損傷和CYP450 mRNA的表達水平，發現大黃素對人正常肝細胞有一定的損傷作用，推測大黃素可以通過誘導CYP1A1 mRNA的表達促進相應底物活化，誘發肝毒性或通過誘導CYP7A1 mRNA的表達，導致膽汁淤積型肝損傷[16]。我們課題組前期研究發現，何首烏水提物及游離蒽醌均可抑制大部分大鼠肝藥酶的表達[17-18]，同時發現何首烏肝毒性與大鼠肝臟CYP1A2或CYP2E1的低活性相關[19]，敲除人肝細胞中某些肝藥酶可顯著增加大黃素等游離蒽醌的肝細胞毒性[20]，推測臨床上何首烏特異質肝毒性可能與人群中基因多態性造成的肝藥酶低表達與何首烏中游離蒽醌所致肝藥酶活性降低雙重作用有關。

本研究結果顯示，何首烏、虎杖、大黃水提物的肝細胞毒性與其游離蒽醌含量成正相關，提示研究這3種中藥肝毒性需重點關注藥材中游離蒽醌含量及游離蒽醌體內代謝情況，如藥物代謝酶基因表達及活性等，為臨床上3種中藥的安全、精準使用提供參考。