幼鵝感染鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

許英民

摘 ?要： 本試驗采取鐵力市地區某鵝場鴨疫里默氏桿菌疑似病料進行細菌分離，并對分離細菌進行生化鑒定、PCR鑒定、動物試驗和藥敏試驗。結果表明：分離的2株細菌均為鴨疫里默氏桿菌，分離菌株對頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，對氨芐西林、慶大霉素、鏈霉素中敏，對環丙沙星、磺胺嘧啶、利福平不敏感。說明頭孢氨芐、頭孢噻肟可作為此養鵝場防治病的首選藥物，其他藥物需減少或停止使用。

關鍵詞： 鵝的鴨疫里默氏桿菌;分離鑒定;藥敏試驗

中圖分類號：S858.33 ? ? 文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2020）4-0045-03

鵝的鴨疫里默氏桿菌（Riemerella ?anatipestifer，RA）是由鴨傳染性漿膜炎引起，是鴨鵝等多種禽類的一種急性或慢性傳染病。主要危害3～8周齡的小鴨或小鵝，在臨床上表現為困倦、眼鼻有分泌物，綠色下痢，共濟失調和抽搐。慢性病例可出現頭頸歪斜。病理變化為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎，是危害養鵝業最主要傳染病之一，如果治療不及時可引起大批死亡，給養鵝業帶來巨大的損失。

在養鵝業的過程中，為了防治細菌性傳染病的發生，盲目使用一些抗菌藥物，導致環境中RA的耐藥性菌株越來越多，表現為多重耐藥和交叉耐藥，并且不同地區不同飼養場RA的耐藥性不同，這就給本病防治帶來很多的困難。RA血清型多，達20多個，主要有1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14和其他未知血清，血清型之間無交叉免疫作用，可因血清型不符合導致疫苗免疫失敗，因此有必要進行RA的分離鑒定，為鴨疫里默氏桿菌病預防提供一定的指導。

1 ?材料

1.1 ?病料來源 ?鐵力市地區發病的養鵝場，無菌采集疑似患有鵝鴨疫里默氏桿菌的病死鵝的心臟、肝臟和腦組織。

1.2 ?培養基、試劑 ?普通營養瓊脂、麥康凱培養基、TSA、TSB均購自北京奧博星生物技術有限責任公司;生化試劑和藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限責任公司;高保真Taq DNA聚合酶購自北京賽百盛基因技術有限公司，細菌DNAout（G+）購自綿陽高新區天澤基因工程有限公司。

1.3 ?試驗動物 ?鐵力市某養鵝場，10日齡未免疫RA的健康雛鵝15只，常規飼養3d，未發現任何異常，可供動物試驗用。

2 ?方法

2.1 ?細菌分離 ?將采集的病料分別劃線接種于麥康凱培養基、普通營養培養基、TSA，并將TSA置于CO2培養箱，普通營養培養基和麥康凱培養基置于普通培養箱，37.0℃恒溫箱培養24h，選擇符合RA特性的菌落，然后涂片、革蘭氏染色，鏡檢，觀察結果。并挑取單個菌落反復劃線觀察，進行分離菌的純度培養。

2.2 ?生化鑒定 ?根據“伯潔細菌鑒定手冊”對分離細菌進行常規的生理生化鑒定[1]。

2.3 ?PCR鑒定 ?①引物的設計與合成：根據Genbank中已發表的RA 16s rRNA基因序列，應用Primer5.0軟件自行設計合成了一對能擴增1115bp基因片段的引物，序列如下：p1：5′GTA TTC ACC GCG CCA TGG CT3' ;P2：5′TTA GTG AGG TAA CGG CTA AC3';②RA基因組DNA的提取：挑取RA單菌落，接種到5mL TSB中，37.0℃振蕩培養過夜，參考細菌DNAout（g+）試劑盒說明書提取全基因組;③PCA體系與反應條件：以提取的RA全基因組為模板，用合成的引物進行PCR擴增，反應條件為：94℃預變性5min;94℃ 1min， 51℃ 1min ，72℃ 1min ，30個循環;72℃ 10min。PCR結束后，取5μL PCR產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，觀察結果。

2.4 ?動物試驗 ?將2株分離菌株分別接種于TSA上，置于CO2培養箱37.0℃培養48h，將平板上所有菌落刮下，混于滅菌生理鹽水中制成細菌懸液，并調整細菌濃度為107CFU/mL。選取15只飼養至13日齡的健康肉鵝雛，隨機分為3組，每組5只，試驗組每只腿部皮下接種菌液0.5mL，對照組用生理鹽水注射。接種后每日觀察，記錄鵝的精神、食欲、飲水、糞便、運動及死亡情況，并對死亡鵝進行病理剖檢，取死亡鵝的心血、肝臟組織進行細菌分離培養。

2.5 ?藥敏試驗 ?參照“獸醫微生物學實驗指導”[2]中圓紙片擴散法，將2株分離株的菌落分別用滅菌生理鹽水洗脫，分別均勻涂布在TSA上，然后將頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考、慶大霉素等15種常用抗菌藥物的藥敏試紙分別貼到平板表面，二氧化碳培養箱37.0℃培養24h，觀察抑菌圈的大小并記錄結果。

3 ?結果與分析

3.1 ?細菌分離[3] ?經鑒別培養和涂片、染色、鏡檢，從采集的病料中分離得到2株疑似RA。細菌在TSA上生長良好，形成光滑、中央隆起、奶油狀的圓形菌落，在普通營養瓊脂和麥康凱培養基上不生長。在顯微鏡下觀察呈革蘭氏陰性、瑞氏染色兩極濃染的短桿菌。

3.2 ?PCR鑒定 ?以提取的細菌DNA基因組為模板，應用合成的P1和P2為引物進行PCR反應擴增目的基因，所獲得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳呈單一條帶，大小與預期1115bp相符。

3.3 ?動物試驗結果 ?2個試驗組的10只小鵝在接種細菌2d后，表現為精神沉郁、食欲減退、眼鼻有分泌物、排黃綠色稀便，死亡之前有頭頸震顫、抽搐、共濟失調、角弓反張等明顯神經癥狀，分別于接種后2～3d出現死亡，對照組的5只小鵝精神、食欲無異常。病死鵝剖檢可見典型的纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎，取腦、心血和肝組織進行細菌分離，其培養特性、生化特性與RA一致。

3.4 ?藥敏試驗結果 ?藥敏結果表明，分離菌對頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，對氨芐西林、丁胺卡那、慶大霉素中敏，對環丙沙星、復方新諾明、利福平不敏感。

4 ?小結與討論

4.1 ?在診斷鵝感染鴨疫里默氏桿菌時，要注意與大腸桿菌病相區別，兩者在臨床癥狀與剖檢變化上極為相似，但在細菌培養特性和生化特性上大不相同。本試驗從臨床疑似病例中分離得到一株細菌，通過培養特性、形態觀察、生化試驗進行鑒定，由于RA生化特性存在一定的差異，生化鑒定結果只能初步鑒定為RA，但RA菌株的獲得可為下一步研究該病有效的防治方法奠定基礎。

4.2 ?臨床上抗菌藥物濫用，導致RA的耐藥性在不斷地增加，給該病的防治帶來很大困難[4，5]。藥敏試驗結果表明，分離菌株對頭孢氨芐、頭孢噻肟、氟苯尼考高敏，可為此養鵝場防治該病的首選藥物，其他藥物須減少或停止使用。

4.3 ?疫苗免疫是預防鵝的鴨疫里默氏桿菌的有效措施之一，由于RA血清型較多，不同血清型間缺乏交叉免疫力，并且該病可出現多種血清型混合感染及新的血清型不斷出現。因此，疫苗免疫效果差。在應用疫苗免疫時，應經常對本地區和本養鵝場的流行菌株進行鑒定，選擇同血清型的疫苗或自家苗進行免疫接種，確保免疫效果。

參考文獻：

[1] ?R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯潔細菌鑒定手冊（中國科學院微生物研究《伯潔細菌鑒定手冊》翻譯組譯）[M].北京：科學出版社.1984;385-388.

[2] ?姚火春.獸醫微生物實驗指導（第2版）[M].北京：中國農業出版社，2002：43-44.

[3] ?陳溥言.獸醫傳染病學（第5版）[M].北京：中國農業出版社，2006：400-401.

[4] ?陳新浩，陳秋英，諸明濤，等.鴨疫里默氏桿菌病病分離及耐藥性調查[J].中國家禽，2010，32（17）50-52.

[5] ?傅心亮，嵇辛勤，夏春玲，等.貴州鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國畜牧獸醫，2013，48（8）155-158.