一例鴨病毒性肝炎與圓環病毒混合感染的實驗室診斷

中圖分類號：S858.324.4+3 ? ? 文獻標識碼：B ? ? 文章編號：1673-1085（2020）4-0034-03

鴨病毒性肝炎（Duck viral hepatitis，DVH）是由鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）引起的，以肝臟病變為主要特征的一種高度致死性傳染病，主要侵害1月齡以內的雛鴨[1]。DHV主要包括鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus， DHAV）、鴨星狀病毒1型和2型，其中DHAV屬于小RNA病毒科的禽肝炎病毒屬[2]。根據中和試驗檢測結果，DHAV可分為3個血清型：DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3。目前，國內流行的主要為DHAV-1和DHAV-3毒株，其中DHAV-1為DHAV的經典毒株，而DHAV-3是分離的DHAV新型毒株[3]。近年來，我國DHAV-3的出現以及DHAV-1和DHAV-3在一些地區的共流行，已經給我國養鴨業造成重大損失。

鴨圓環病毒（Duck circovirus，DuCV）屬于圓環病毒科圓環病毒屬，是近些年新發現的禽類病毒病原。根據病毒基因組序列可以分為I型和II型，目前在我國主要養鴨地區流行毒株以I 型為主[4]。DuCV可以感染各日齡和品種鴨，也可以感染鵝。DuCV主要侵害免疫系統，導致機體免疫力降低而易于繼發其它疾病，與其它鴨病毒混合感染普遍[5]，造成生產上診療困難，耽誤最佳治療時期。

近期實驗室接診了某養殖公司送檢的疑似鴨病毒性肝炎病例，通過實驗室診斷確定為DHAV-3和DuCV-I混合感染，現報道如下，以期為該地區鴨病毒性肝炎和鴨圓環病毒的防控提供有效參考。

1 ?材料與方法

1.1 ?病料采集與處理 ?發病鴨來自山東地區某養鴨場30日齡櫻桃谷鴨，表現精神萎靡，采食下降，死亡率0.25%左右。剖檢可見肝臟條紋狀出血，腎臟腫脹明顯，脾腫大，少量心包積液，有的胰腺點狀出血。采集病死鴨肝臟、脾臟和胰腺等作為病料，混合后以1：5比例加入滅菌生理鹽水，使用組織勻漿機將病料打碎形成混懸液，置-80℃凍融2次，4℃ 8000g離心15min，取上清進行實驗室PCR檢測。

1.2 ?PCR鑒定

1.2.1 ?組織核酸提取 ?處理好的病料上清按照試劑盒（Axyen）說明書提取病毒核酸，并于-20℃保存備用。

1.2.2 ?引物設計和PCR檢測 ?利用本實驗室設計的針對禽流感病毒（AIV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）、鴨肝炎病毒（DHV）、鴨呼腸孤病毒（DReoV）、鴨細小病毒（DPV）和鴨圓環病毒（DuCV）等常見病原的引物，通過PCR或RT-PCR方法進行病毒核酸檢測。

PCR反應體系25μL：2×Taq PCR StarMix 12.5μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，DNA模板2μL，超純水9.5μL。擴增條件：94℃預變性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 90s，35個循環;72℃延伸5min。

RT-PCR反應體系20μL：2×One Step Mix 10μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5μL，One Step Enzyme Mix 1μL，超純水5μL，RNA模板3μL。擴增條件：50℃反轉錄30min，94℃預變性2min;94℃ 20s，50℃ 20s，72℃ 30s，35個循環;72℃延伸5min。

PCR產物用1.5%瓊脂糖電泳進行檢測后，凝膠成像系統觀察并記錄結果。并將PCR陽性樣品進行測序。

2 ?結果

2.1 ?病理解剖與病變觀察 ?剖檢6只病死雞，主要眼觀病理變化為肝臟條紋狀出血，見圖1;腎臟腫大呈花斑狀，見圖2。

2.2 ?實驗室PCR檢測 ?病毒核酸檢測結果顯示，DHAV-3為陽性，電泳條帶大小為240bp;DuCV-I為陽性，電泳條帶大小為460bp;其他常見病毒均為陰性。結果見圖3。

3 ?討論

近年來隨著養鴨業的發展，規模化密集養殖模式的增多，鴨疾病爆發的危害更加嚴重。由于免疫壓力等因素的影響，鴨甲型病毒性肝炎呈現出新的流行態勢。1963年在中國首次報道了該病[6]，隨后，國內越來越多的鴨肝炎病毒毒株（DHAV-1）被發現。2002年，蘇敬良等報道了一例新型鴨肝炎病毒（DHAV-3），且DHAV-1和DHAV-3之間交叉保護力很差[7]。何冉婭等對華南地區分離的18株DHV進行病原學檢測發現有15株為DHAV-3[8]。Fu等對28份死亡雛鴨的肝臟樣品進行核苷酸序列分析和血清型分析，分離到15株DHAV-3[9]。

目前，DHAV-3已成為引起我國鴨肝炎的主要病原之一，且流行地域分布存在不斷擴大的態勢。目前，沒有商品化的疫苗用于DHAV-3的防控，雖然DHAV-1和DHAV-3抗體可以用于鴨甲型病毒性肝炎治療，但實際生產中，DHAV仍時有發生，這可能與混合感染其他鴨病毒有關。

在本病例中，除DHAV-3以外還檢測到DuCV-I型病毒。DuCV最初在德國發現，隨后在美國、韓國、中國等國家發現并流行[10]。鴨圓環病毒主要引起鴨生長發育不良，生產性能下降，免疫器官萎縮，淋巴組織受損，引起免疫抑制，通常與其他病原體共同感染使疾病進展更加復雜[11]。

DuCV感染陽性率高低不一，近年來我國山東、福建、廣東養鴨大省的感染情況日趨嚴重[12]。DuCV病毒分離較困難，因此沒有商品化的疫苗產品可供使用。該病以預防為主，養殖場應采取嚴格的生物安全手段，嚴防鴨圓環病毒病的發生和流行。

鴨病毒性肝炎和鴨圓環病毒病均是當前危害養鴨業的重要傳染病。由于DuCV感染普遍存在，近來DHAV病例經常能夠同時檢測到DuCV，因此推測這可能是DHAV防控失敗的原因之一。但是，由于缺乏實驗證據，DHAV和DuCV 是否能夠協同致病以及其協同致病機理仍需進一步研究。

參考文獻：

[1] ?Y. l. Lai， N. Zeng， M. S. Wang， et al. The VP3 protein of duck hepatitis A virus mediates host cell adsorption and apoptosis [J]. Scientific reports 2020， 9 （1）， 16783.

[2] ?萬春和，陳翠騰，施少華，等.鴨甲肝病毒2型TaqMan實時熒光定量PCR方法的建立[J].中國家禽，2019，41（15）：23-27.

[3] ?Wen X， Zhu D， Cheng A，Wang M， et al. Molecular epidemiology of duck hepatitis a virus types 1 and 3 in China，2010-2015[J]. Transboundary and emerging diseases2018，65（1）：10-15.

[4] ?朱衛華，趙亭，趙萬升，等. 一例種鴨病毒性腸炎與圓環病毒混合感染的實驗室診斷[J].家禽科學， 2019（11）：51-53.

[5] ?Li P， Li J， Zhang R， Chen J， et al. Duck “beak atrophy and dwarfism syndrome” disease complex： Interplay of novel goose parvovirus-related virus and duck circovirus？[J].Transboundary and emerging diseases 2018， 65（2）：345-351.

[6] ?黃均建.小鴨病毒性肝炎研究[M].上海：上海農科院畜牧獸醫研究所單行本，1963。

[7] ?蘇敬良，黃瑜，賀榮連，等.新型鴨肝炎病毒的分離及初步鑒定[J].中國獸醫科技，2002， 32（1）： 15-16.

[8] ?何冉婭，于淼，張玉玲，等.2007-2009年華南地區鴨肝炎病毒流行病學調查及分離株的VPl基因變異分析[J]. 中國動物傳染病學報，2010，18（1）：7～15.

[9] ?Fu Y，Pan M，Wang X，et al.Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly from clinical specimens [J].Veterinary microbiology 2008，

131（3-4）：247-257.

[10] ?Chen CL，Wang PX， Lee MS， et al. Development of a polymerase chain reaction procedure for detection and differentiation of duck and goose circovirus [J]. Avian diseases 2006， 50（1）：92-95.

[11] ?洪炳發.一例鴨圓環病毒感染的診治[J].中國畜禽種業，2019，15（12）：171-172.

[12] ?陶廣朋.鴨圓環病毒的流行與防控[J].中國畜禽種業，2019，15（09）：192.