解磷細(xì)菌的分離篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

鄭喜清 邸娜 張志超 紀(jì)曉貝

摘? ? 要：通過透明圈法與鉬銻抗比色法，從巴彥淖爾市臨河區(qū)舊氣象局試驗(yàn)田植物根際土中分離篩選出3株解磷效果好的菌株，通過單因素試驗(yàn)對菌株培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：不同碳源、氮源、溫度、pH值、鹽濃度等對其解磷效果存在顯著差異。PB1以木糖做碳源、硝酸銨為氮源、NaCl濃度為0.3 g·L-1、pH值為6、溫度30～34 ℃、加液量為100 mL時(shí)解磷效果最顯著;PB2以果糖做碳源、硝酸銨為氮源、鹽濃度為0.7 g·L-1、pH值為6、溫度30～34 ℃、加液量為50 mL時(shí)最顯著。PB3以葡萄糖或果糖做碳源、硝酸鈉為氮源、鹽濃度為0.5 g·L-1、pH值為6、溫度32 ℃、加液量為100 mL時(shí)解磷效果最顯著。根據(jù)形態(tài)特征及生理生化特性，結(jié)合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》、《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》將3種菌株初步鑒定為：PB1為沙門氏菌、PB2為金桿菌屬、PB3為芽孢桿菌屬。

關(guān)鍵詞：解磷菌;條件優(yōu)化;解磷能力

中圖分類號：S144.9? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.01.004

Isolation and Screening of Phosphate-solubilizing Strains and Optimization of Culture Conditions

ZHENG Xiqing， DI Na，ZHANG Zhichao， JI Xiaobei

（Agriculture Department， Hetao College， Bayannaoer， Inner Mongolia 015000， China）

Abstract： Through transparent circle method and molybdenum antimony colorimetric method， 3 strains with good phosphorus-solubilizing effect were isolated and screened from the rhizosphere soil of? plants， in the experimental field of Linhe District of Bayannaoer City. The culture condition of strain was optimized by single factor test.The results showed that different carbon sources， nitrogen sources， temperature， pH and salt concentration had significant differences in their phosphorus removal effects. When PB1 used xylose as carbon source， ammonium nitrate as nitrogen source， NaCl concentration was 0.3 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. PB2 was most significant when fructose was used as carbon source， ammonium nitrate was used as nitrogen source， salt concentration was 0.7 g·L-1， pH was 6， temperature was 30～34 ℃， and liquid dosage was 50 mL. When PB3 used glucose or fructose as carbon source， sodium nitrate as nitrogen source， salt concentration was 0.5 g·L-1， pH is 6， temperature was 32 ℃， and liquid dosage was 100 mL， the phosphorus removal effect was the most significant. According to the morphological characteristics and physiological and biochemical characteristics， combined with the Manual for Identification of Common Bacterial Systems and Berger's Manual for Identification of Bacteria， the three strains were preliminarily identified as： PB1 was Salmonella， PB2 was Bacillus genus， and PB3 was Bacillus.

Key words： Phosphate solubilizing Bacteria;medium optimization; phosphate dissol- ving ability

磷是植物生長所必需的礦質(zhì)元素，在植物生長、發(fā)育等生命活動中起著積極的作用。在我國74%的耕地土壤缺磷，其中95%的土壤中的磷以難溶態(tài)形式存在，很難被植物直接吸收利用。土壤中可被植物吸收利用的磷僅占全磷量的1% 。磷肥施入土壤后，土壤膠體對無機(jī)磷有強(qiáng)烈的吸附和固定作用，轉(zhuǎn)變成植物難以吸收利用的無效態(tài)磷，導(dǎo)致土壤中肥料比例嚴(yán)重失調(diào)、土壤板結(jié)及退化、磷肥利用率低[1-2]。因此，如何開發(fā)和有效利用這部分被土壤固定的磷是目前我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中急需要解決的問題。大量研究表明，土壤中存在大量的溶磷微生物，包括細(xì)菌、放線菌和真菌，可以將土壤難溶性的磷轉(zhuǎn)變成植物可以吸收利用的可溶性磷[3-4]，達(dá)到提高土壤磷素有效性、使作物增產(chǎn)的目的[5-7]。目前，己報(bào)道的具有較強(qiáng)溶解難溶磷酸鹽的菌株有芽抱桿菌屬、埃希氏菌屬、青霉屬，我國主要應(yīng)用解磷巨大芽抱桿菌（Bacillus megatarium）生產(chǎn)溶磷生物肥料[8]。

由于解磷菌具有有效解磷、促植物生長能力以及不易導(dǎo)致環(huán)境污染與資源浪費(fèi)等優(yōu)勢，以往很多研究者一直致力于開發(fā)解磷菌劑以制備更高效的生物磷肥來改善目前的不良狀況。但是，到目前為止，解磷菌劑的應(yīng)用還存在一些問題，實(shí)驗(yàn)室中解磷菌的培養(yǎng)條件與自然土壤的環(huán)境條件差別太大，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分非常豐富，導(dǎo)致解磷菌在土壤這樣相對寡營養(yǎng)的條件下不能很好地發(fā)揮作用。因此，本試驗(yàn)從土壤中分離篩選解磷效果好的菌株，研究生理生化特征，并對其進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化，確定合適的碳源、氮源、溫度、pH值、鹽濃度、裝液量對解磷能力的影響，結(jié)合形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)進(jìn)行分類鑒定，為微生物菌肥的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試土樣

土樣來源于巴彥淖爾市臨河區(qū)舊氣象局試驗(yàn)田種植的西紅柿、尖椒、青椒、茄子、西蘭花、黃瓜6種植物的根際土。采用5點(diǎn)取樣法，除去表層土壤取樣，混勻，放入自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH值 7.0～7.2，蒸餾水1 000 mL，121 ℃，滅菌30 min，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g。

有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、（NH4）2SO4? 0.5 g、KCl 0.3 g、NaCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·4H2O 0.03 g、CaCO3 5.0 g、卵磷脂0.2 g、蒸餾水1 000 mL、pH值 7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g。

無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g、Ca3（PO4）2 5.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、酵母粉0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH值 6.8～7.2，固體培養(yǎng)基加瓊脂15～20 g。

1.3 土壤中解磷菌分離

稱取10 g土樣溶于90 mL無菌水中，震蕩30 min后，取上清液按10倍稀釋法稀釋樣品，每個(gè)濃度取0.1 mL分別涂布到分離培養(yǎng)基上[9]，28 ℃下培養(yǎng)5 d。觀察生長情況，記錄出現(xiàn)透明圈的菌落，再挑取有明顯透明圈的菌落，進(jìn)一步通過劃線法純化，直至得到純菌株后，轉(zhuǎn)接到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，保存于4 ℃冰箱中[10]。

1.4 解磷能力測定

溶磷菌初篩：將分離純化后的菌株接種到有機(jī)磷、無機(jī)磷培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，通過溶磷圈法測量解磷圈直徑（D）與菌落生長直徑（d）比值大小，初步篩選具有溶磷能力的菌株。

溶磷菌復(fù)篩：將初篩得到的解磷菌株接種到磷液體培養(yǎng)基中，對照加等量的無菌水，接種后28 ℃，160? r·min-1搖床培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)好的磷細(xì)菌液1.2萬r·min-1離心5 min，取上清液，根據(jù)鉬銻抗比色法測定上清液中溶磷量[10-11]，進(jìn)一步判斷溶磷能力。

1.5 菌株鑒定

形態(tài)特征鑒定：將菌株劃線接種于LB平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d，觀察單菌落的形態(tài)特征，另取新鮮培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，觀察其顯微形態(tài)。

生理生化特性鑒定：淀粉水解、甲基紅反應(yīng)、明膠水解、氧化酶活性測定、過氧化氫試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、運(yùn)動性和需氧性測定等生理生化試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[12-13]的方法進(jìn)行。

1.6 培養(yǎng)條件優(yōu)化[14-16]

以磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別對碳源、氮源、溫度、pH值、鹽濃度、裝液量采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，供試因素及水平見表1，每個(gè)處理3次重復(fù)，相同條件下培養(yǎng)5 d后，測定解磷能力，從而確定最佳的碳源、氮源、溫度、pH值、鹽濃度、裝液量。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Exce12003、SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷菌的篩選

在巴彥淖爾市臨河區(qū)舊氣象局試驗(yàn)田西紅柿、尖椒、青椒、茄子、西蘭花、黃瓜6種植物的根際土中篩選到解磷菌株15種。通過透明圈大小初步篩選出3種解磷效果較好的磷細(xì)菌，編號分別為PB1、PB2、PB3（圖1）。

2.2 磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖2可知，磷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.502 2x+0.002 5，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 2，表明兩者線性相關(guān)良好。

2.3 解磷能力測定

溶磷圈直徑（D）和菌落生長直徑（d）的比值（D/d），是表征解磷細(xì)菌的相對解磷能力的一個(gè)指標(biāo)，可以初步確定其解磷效果。由表2可知，PB2溶磷圈直徑（D）與菌落生長直徑（d）比值最大為1.18，解磷能力最強(qiáng)，其次是PB3，PB1最小。根據(jù)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出有效含磷量，結(jié)果表明PB1有效含磷量最高為1.567，解磷效果最好，其次PB2，PB3解磷效果最差。

2.4 菌株形態(tài)鑒定

PB1、PB2、PB3三種菌株菌落與培養(yǎng)基結(jié)合程度都較為良好，濕潤、乳白色、表面均較為平整、無隆起、正反面無色差、不透明，其中除PB3外，其他2種菌落邊緣都不規(guī)整。

由圖3可知，PB3為長桿狀、有分枝，PB1短桿狀、有芽孢，PB2短桿狀。3種菌革蘭氏染色均為陽性。

2.5 生理生化特性鑒定

由表3可知，3個(gè)菌株淀粉水解、明膠水解、過氧化氫試驗(yàn)反映均為陰性;甲基紅反應(yīng)PB2為陰性，PB1、PB3均為陽性;檸檬酸鹽試驗(yàn)、運(yùn)動性測定PB1為陽性，PB2、PB3均為陰性;氧化酶活性PB2為陽性，PB1、PB3均為陰性;PB1為兼性厭氧，PB2、PB3均為好氧型。