鹽脅迫對熱帶假絲酵母菌株GY8降酚性能的影響

呂建華 李宏 曲文浩 賈周英 薛智權

摘? ? 要：本文旨在檢測不同濃度氯化鈉脅迫對高效降酚菌熱帶假絲酵母菌株GY8降解苯酚性能的影響。通過在含有0.1，10，25，50，100 g·L-1氯化鈉的無機鹽培養基中培養GY8菌，檢測不同氯化鈉濃度脅迫對菌OD600值、降解苯酚速率，降酚關鍵酶的活性的影響。結果表明，GY8菌在含0～100 g·L-1鹽濃度培養基中均可生長，且都有降酚活性。但隨著鹽濃度增加，GY8菌OD600值和降酚速率及鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶酶比活力均呈現抑制趨勢，苯酚羥化酶的活性先增強后抑制。當氯化鈉濃度超過25 g·L-1時，抑制作用明顯增強。通過本研究可以得出GY8菌可耐受0～100 g·L-1氯化鈉，且氯化鈉對GY8降酚活性具有梯度抑制作用。

關鍵詞：降酚性能;熱帶假絲酵母菌;氯化鈉;苯酚羥化酶;鄰苯二酚雙加氧酶

中圖分類號：Q93? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.03.003

Effect of Salt Stress on the Phenol Degradation of Candida tropicalis GY8

LYU Jianhua， LI Hong， QU Wenhao， JIA Zhouying， XUE Zhiquan

（College of Life Science，Shanxi Agricultural University，Taigu， Shanxi? 030801，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the influence of different concentration of sodium chloride stress on phenol-degrading activity of Candida tropicalis GY8. GY8 strain were cultured in the inorganic salt medium containing 0.1， 10， 25， 50 and 100 g·L-1 sodium chloride. The effects of different concentrations of sodium chloride on the OD600 value， the phenol-degrading rate， and the key enzyme activities for phenol degradation were detected. The results showed that GY8 strain could grow in the culture medium containing 0～100 g·L-1 salt concentration， and all of them had the activity of phenol degradation. However， with the increase of salt concentration， the OD600 value， the phenol-degrading rate and the specific activity catechol 1， 2-dioxygenase of GY8 strain showed inhibitory trend. The activity of phenol hydroxylase increased first and then inhibited. When the concentration of sodium chloride was more than 25 g·L-1， the inhibition was obviously enhanced. This study concluded that GY8 strain can tolerate 0～100 g·L-1 salt concentration， and NaCl has a gradient inhibitory effect on the phenol-degrading activity of GY8.

Key words： phenol degradation; Candida tropicalis; sodium chloride; phenol hydroxylase; catechol 1， 2-dioxygenase

苯酚及其衍生物作為重要的有機化工原料，主要用于生產酚醛樹脂、烷基酚以及水楊酸等，被廣泛應用于石油化工、醫藥、印染、造紙等行業[1-2]。在苯酚的制備和使用過程中都會使大量苯酚隨著工業廢水被排放，從而對環境造成影響。因此，含酚廢水在排放時要進行預處理。

對于廢水中苯酚的處理可利用物理、化學和生物處理方法，但由于生物處理具有高效、經濟和環保效果而備受關注。近20年來，許多學者已經對生物降解苯酚進行了嘗試。研究表明，許多微生物能夠耐受低濃度的苯酚，并且將酚類化合物分解代謝成無害的最終產物，因此，利用微生物處理含酚廢水是非常有效的方法[3-4]。

采用微生物降解工業廢水中的苯酚時，其降解效果會受到許多因素的影響。目前，國內外在制備苯酚時，為了提高產量，常常加入大量含鈣、鎂、氯化鈉等無機鹽催化劑，從而使后期廢水中常同時含有苯酚以及高濃度的鹽分[5]。已有研究表明在采用活性污泥法處理廢水時，鹽度可以調控污泥的脫水性能，因此，常在活性污泥中加入一定的氯化鈉來提高污泥的固含量[6]。但氯化鈉的濃度太高會對微生物的生長產生抑制作用[7-9]。因此，為了使微生物能夠更好地生長繁殖，探究不同濃度鹽脅迫對菌株降解苯酚性能有何影響就變得尤為重要。

熱帶假絲酵母菌是一種高效降解苯酚的真菌，但鹽脅迫對菌株降解苯酚性能的影響還未見報道，本實驗組從污水處理廠的活性污泥中分離得到了一株具有較高降酚活性的熱帶假絲酵母GY8，并對其基本性質進行了研究[10]。本試驗擬采用不同濃度的氯化鈉對熱帶假絲酵母GY8菌株進行鹽脅迫，觀察高鹽對其生長特性、降酚特性及降酚關鍵酶活性的影響，為將熱帶假絲酵母GY8菌株應用于高鹽含酚廢水的處理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 本研究所用降解苯酚菌株熱帶假絲酵母 GY8篩選自山西省晉中市太谷縣圣源污水處理廠曝氣池中的活性污泥，并由本實驗組保存。

1.1.2 培養基 PDA培養基和PDB培養基：參照本實驗室常規方法配制[10]。

無機鹽篩選培養基（g·L-1）：參照本實驗室常規方法配制[11]，加入終濃度為0.1，10，25，50和100 g·L-1的氯化鈉，每個濃度設置3個平行組。

1.1.3 試劑 本試驗中所用化學試劑均為分析純，PDA培養基和PDB培養基購自北京澳博星科技公司，酵母提取物購自OXOID公司，NADPH購自上海羅氏制藥有限公司。其余為國產分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 熱帶假絲酵母 GY8菌株活化 將保存菌株熱帶假絲酵母 GY8在PDA固體培養基上劃線，28 ℃恒溫培養箱培養2 d。從PDA培養板挑取活化的單克隆菌，接種到滅菌的含PDB培養基的試管中，28 ℃，180 rpm，培養2 d后作為后續試驗使用菌株。

1.2.2 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株生長影響 將1.2.1中培養的菌株接種到以苯酚為唯一碳源，氯化鈉濃度為0.1，10，25，50和100 g·L-1的無機鹽液體培養基中，置于28 ℃恒溫震蕩器中，180 rpm，培養2 d，在培養結束后，將培養液搖勻，從每個培養瓶中取150 μL菌液于酶標板中，以蒸餾水為空白對照，測600 nm波長下菌液的OD值。

1.2.3 苯酚含量的測定 本文采用4-氨基安替比林法[12]來測定苯酚的含量，略有改進。將培養液于5 000 r·min-1離心5 min后，取上清按照本實驗室常規方法測定苯酚含量[11]。

1.2.4 鹽脅迫對苯酚降解酶活性的影響 （1）粗酶液的提取。將1.2.2中離心后的菌體沉淀用pH=7.6磷酸緩沖液清洗兩次，然后用磷酸緩沖液重懸細胞，加入終濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K，放入Scientz-65OE超聲波細胞破碎儀中，設定超聲工作時長5 s，間隙時長8 s，功率250 W，總工作時長為35 min，超聲破碎后，于4 ℃，12 000 r·min-1，離心20 min，收集上清液即為粗酶液[13]。

（2）酶活的測定。苯酚羥化酶活力測定參照文獻[14]，苯酚羥化酶反應體系總體積為150 μL。每個樣品依次加入水，12 μL苯酚（終濃度20 μmol·L-1），6 μL Tris-H2SO4（100 μmol·L-1，pH值7.6），粗酶液和6 μL NADPH（100 μmol·L-1），混勻后取150 μL加入酶標板，以126 μL水，12 μL苯酚，6 μL Tris-H2SO4，6 μL NADPH作為空白對照，用Muitiskan GOI酶標儀檢測在340 nm處反應6 min內OD值的變化。其中1個單位（U）的苯酚羥化酶活性被定義為每毫克蛋白每分鐘氧化1 μmol NADPH所需酶量。鄰苯二酚-1， 2-雙加氧酶（C12O）活性測定參照文獻[11]，以單位時間內反應產物（粘糠酸）在260 nm處吸光度變化表示。鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶反應體系總體積為3 mL。每個樣品中依次加入水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巰基乙醇（3.3 mmol·L-1），粗酶液，15 μL鄰苯二酚（100 μmol·L-1）。以984 μL水，2 mL Tris-HCL（50 mmol·L-1，pH值8.0），1 μL β-巰基乙醇（3.3 mmol·L-1），15 μL鄰苯二酚作為空白對照，用石英比色皿測在260 nm處OD值的變化。總蛋白含量用Bradford 法測定。酶的比活力以每毫克的蛋白質中所含酶的活力單位數計算，計算公式如下：

酶的比活力=（（ΔAs-ΔAb）·V）/（ [ε·d·ΔT·mg （protein）]）

式中，ΔAs-樣品吸光度的變化值;ΔAb-空白對照吸光度的變化值;V-反應體系總體積;ε-摩爾吸光系數;ΔT-反應時間。ε340 = 6 220 L·mol-1·cm-1，ε260=16 800 L·mol-1·cm-1，ε375 = 44 700 L·mol-1·cm-1。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株生長的影響

隨著培養基中氯化鈉濃度的逐漸升高，熱帶假絲酵母GY8菌液OD600值逐漸降低，表明菌液濃度越來越低，說明熱帶假絲酵母GY8菌株的生長隨著氯化鈉濃度的升高逐漸被抑制。其中在10 g·L-1氯化鈉脅迫下較0.1 g·L-1脅迫時下降了20.7%，而25 g·L-1氯化鈉脅迫下生長明顯受到抑制，較0.1 g·L-1脅迫時下降了49.3%（圖1）。

2.2 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株苯酚降解率的影響

隨著培養基中氯化鈉濃度的逐漸升高，氯化鈉脅迫下熱帶假絲酵母GY8菌株對苯酚的降解率與菌株的生長都呈現一致的下降趨勢，說明隨著氯化鈉濃度的升高，由于菌株生長受到抑制，從而導致菌株對苯酚的降解也逐漸被抑制。其中10 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚降解較0.1 g·L-1時下降了0.18個百分點，而在25 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚降解明顯受到抑制，較0.1 g·L-1時下降了0.58個百分點，較生長受抑制更加明顯（圖2）。

2.3 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株苯酚羥化酶活性的影響

當熱帶假絲酵母GY8菌在含有氯化鈉的培養基中生長時，苯酚羥化酶的酶比活力呈現先上升后下降趨勢。苯酚羥化酶在受到10 g·L-1氯化鈉脅迫時活性呈現上升趨勢，較0.1 g·L-1時酶活性提高了15.2%，從而在菌生長受到抑制時苯酚降解抑制程度減緩。當菌株在超過25 g·L-1氯化鈉脅迫下苯酚羥化酶活性明顯受到抑制，較10 g·L-1時下降21.3%（圖3）。

2.4 鹽脅迫對熱帶假絲酵母GY8菌株鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性的影響

當熱帶假絲酵母GY8菌生長的環境中氯化鈉濃度逐漸升高時，鄰苯二酚1，2-雙加氧酶的酶活力呈現明顯下降趨勢，且在10 g·L-1氯化鈉脅迫時活性呈現明顯抑制作用，較0.1 g·L-1時酶活性降低了72.8%，表明鄰苯二酚1，2雙加氧酶的表達受到氯化鈉的明顯抑制（圖4）。

3 結論與討論

近年來，從含酚類污染物的環境中分離出各種能夠降解苯酚的微生物菌株。研究者還詳細地研究了這些菌株代謝苯酚的途徑及其基因調控機制[15]。目前，大量的研究工作結果表明，微生物對酚類污染物的降解存在著有效的作用和可觀的未來，降酚菌依靠苯酚羥化酶和鄰苯二酚1， 2-雙加氧酶來降解苯酚[16]。然而，我國的工業特別是化學工業排放的含酚廢水中往往含有很高濃度的鹽[4]，不利于微生物降解苯酚，因此，用微生物法處理鹽濃度高的含酚廢水變得非常困難。研究表明，菌株在10～100 g·L-1 的NaCl溶液條件下均能夠進行生長，并對苯酚有降解能力，且菌株生長量和苯酚的降解率隨著鹽度的增加而降低，其羥化酶比活力隨之降低[17]。過高鹽度會抑制鄰苯二酚1，2-雙加氧酶基因的表達，其表達水平隨鹽度升高呈下降趨勢[18]。本研究結果中發現濃度低于10 g·L-1的鹽環境有利于提高苯酚羥化酶活性，而隨著鹽濃度逐漸升高，苯酚羥化酶和鄰苯二酚1，2-雙加氧酶活性菌受到明顯抑制作用，因此，高濃度鹽的生長環境不利于熱帶假絲酵母GY8菌對苯酚的轉化降解，增大了苯酚降解的難度。通過本實驗研究可以通過調整廢水中鹽度于酶活性范圍內，從而為該菌株在鹽度較高的含酚廢水的處理應用中提供理論依據。

參考文獻：

[1]NAWI M A ， NAWAWI I . Preparation and characterization of TiO2 coated with a thin carbon layer for enhanced photocatalytic activity under fluorescent lamp and solar light irradiations[J]. Applied catalysis a： general， 2013， 453（Complete）：80-91.

[2]楊建設， 張冬梅， 陳茂壕， 等. 不同苯酚濃度下耐酚優勢菌的活力比較[J]. 茂名學院學報， 2002， 12（4）： 13-17.

[3]NAIR C I， JAYACHANDRAN K， SHASHIDHAR S. Biodegradation of phenol[J]. African journal of biotechnology， 2008，7（25）：4951-4958.

[4]KATAYAMA-HIRAYAMA K， TOBITA S， HIRAYAMA K. Biodegradation of phenol and monochlorophenols by yeast Rhodotorula glutinis[J]. Water science & technology， 1994， 30（9）：59-66.

[5]張海濤， 劉文斌， 楊海君，等. 一株耐鹽高效苯酚降解菌的篩選、鑒定、響應面法優化與降酚動力學研究[J]. 環境科學學報， 2016， 36（9）： 3200-3207.

[6]胡夢竹， 張海豐， 梁毅， 等. NaCl對污泥脫水性能及胞外聚合物分層結構的影響[J]. 工業水處理， 2018， 38（12）：64-68.

[7]JUANG Ruey-Shin， HUANG Wen-Ching， HSU Ya-Han. Treatment of phenol in synthetic saline wastewater by solvent extraction and two-phase membrane biodegradation[J]. Journal of hazardous materials， 2009， 164（1）：46-52.

[8]LIVINGSTON A G， SANTOS L M F D， PAVASANT P， et al. Detoxification of industrial wastewaters in an extractive membrane bioreactor[J]. Water? science &technology， 1996， 33（3）：1-8.

[9]王祖佑， 馬慶霞， 陳怡，等. 優勢降酚菌的篩選及其生長條件優化研究[J]. 化學與生物工程， 2010， 27（4）： 61-62.

[10]呂建華， 李宏， 薛智權. 高效降酚菌株GY8培養基的優化[J]. 天津農業科學， 2016， 22（9）：40-44.

[11]任瑞凡， 劉永陽， 曲文浩， 等. 一株苯酚降解菌株的篩選鑒定及特性研究[J]. 天津農業科學， 2018， 24（11）：11-16， 50.

[12]國家環保局《水和廢水監測分析方法》編委會. 水和廢水監測分析方法（第四版）[M] . 北京：中國環境科學出版社， 2002： 294-295.

[13]DONG X J， HONG Q， HE L J， et al. Characterization of phenol-degrading bacterial strains isolated from natural soil[J]. International biodeterioration & biodegradation， 2008， 62（3）：257-262.

[14]NEUJAHR H Y， GAAL A. Phenol hydroxylase from yeast. Purification and properties of the enzyme from Trichosporon cutaneum[J]. European journal of biochemistry， 1973， 35：386-400.

[15]馬放， 任南琪， 楊基先. 污染控制微生物學實驗[M]. 哈爾濱：哈爾濱工業大學出版社， 2002.

[16]PESSIONE E， DIVARI S， GRIVA E， et al. Phenol hydroxylase from Acinetobacter radioresistens is a multicomponent enzyme[J]. Febs journal， 1999， 265（2）：549-555.

[17]譚東徽， 曲媛媛， 馬放. Arthrobacter sp.W1苯酚降解特性及其羥化酶基因獲取[J]. 哈爾濱工業大學學報， 2010， 42（12）： 1977-1980.

[18]胡日查， 孫立波. 低溫1， 2， 4-TCB降解菌的選育、降解特性及鄰苯二酚 1， 2-雙加氧酶基因表達水平[J]. 環境工程學報， 2013， 7（2）： 777-782.