SPE-UPLC-MS/MS直接測定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

孫文閃，章虎，張安平，諸駿杰，余鵬飛，沈雄雅

1. 綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310051）；2. 浙江工業大學環境學院（杭州 310014）

草甘膦（Glyphosate，Gly）作為無選擇類除草劑，以其高效、低毒、廉價等特性被廣泛運用于全球各個農業和非農業領域[1-2]。草甘膦在環境和生物體中富集并通過食物鏈進入人體，進而對人體健康造成危害。隨著草甘膦在農業生產中的廣泛使用，其及其主要代謝產物氨甲基膦酸（Aminom ethyl phosphonic acid，AMPA）殘留問題也越來越受關注。GB 2763—2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對草甘膦的最大殘留量有如下規定：谷物0.1～0.5 mg/kg，水果0.1～0.5 mg/kg，茶葉1 mg/kg。草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸都具有易溶于水，難溶于一般有機溶劑，難揮發，缺少發色和熒光基團等特性，因此運用常規方法進行檢測比較困難[3]。目前，草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸檢測方法有氣相色譜（GC）法[4]、離子色譜（IC）法[5-8]、液相色譜（LC）法[9-10]、氣相色譜質譜（GC-MS）法[11]、液相色譜質譜（LC-MSMS）法[12-17]、電感耦合等離子體質譜儀（ICP-MS）[18]等，但是這些方法大部分需要衍生反應，時間長甚至要過夜，操作程序繁瑣，穩定性差，靈敏度低，有機試劑污染嚴重，難以直接運用在食品樣品的檢測中。因此建立一種簡單、便捷、有效的草甘膦及其代謝物殘留的檢測方法具有重要的意義。試驗建立了SPEUPLC-MS/MS直接測定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的方法，該方法簡便、快捷、有效，前處理步驟少，有機溶劑消耗量小，無需使用酸堿試劑調節pH，樣品無需衍生，結果穩定性高，可滿足各類食品的檢測需求。

1 試驗部分

1.1 主要儀器與試劑

LC30A液相色譜（日本島津公司）；ABSCIEX QTRAP 5500質譜系統（美國AB SCIEX公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山舒美）；ST16R高速離心機（美國賽默飛世爾公司）；EUFO-945616渦旋震蕩器（TALBOYS）；Milli-Q型超純水儀（美國密理博公司）；BSA224S電子天平（德國賽多利斯公司）；Oasis HLB固相萃取小柱（5 mL/200 mg，Waters公司）；0.22 μm水溶性濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；1 mL醫用注射器（島津技邇（上海）商貿有限公司）；50 mL離心管（美國賽默飛世爾公司）。

乙腈、二氯甲烷（色譜純，德國CNW科技公司）；乙酸銨（質譜純，美國賽默飛世爾公司）；草甘膦以及氨甲基膦酸標準品（純度＞98%，德國Dr Ehrenstofer公司）。樣品市售。

1.2 樣品前處理

提取：稱取2 g（精確到 0.001 g）樣品于 50 mL聚丙烯離心管中，加入10.0 mL超純水，渦旋混合3 min，超聲提取20 min，再加入5 mL二氯甲烷，渦旋混合2 min，以 8 000 r/min離心 5 min，上清液待凈化。

凈化：取2 mL上清液，過HLB-SPE小柱凈化，HLB-SPE小柱先經過5 mL的純水和5 mL甲醇活化，前1 mL上清液過柱，棄去不要，后1 mL過柱后收集，過0.22 μm水溶性濾膜，待上機。

1.3 儀器條件

液相色譜條件：色譜柱Waters BEH Amide氨基柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱溫35 ℃；進樣量5 μL；流速0.25 mL/min；流動相，A-乙腈，B-5 mmol/L乙酸銨溶液，氨水調節至pH 11，洗脫程序見表1。

表1 洗脫程序

質譜條件：離子源，電噴霧離子源（ESI），負離子模式；離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；氣簾氣流量40.0 psi；噴霧氣流量60.0 psi；輔助加熱氣流量60.0 psi；掃描方式，多反應監測（MRM）；監測離子對見表2。

表2 草甘膦以及氨甲基膦酸的質譜參數

1.4 標準溶液配制

分別稱取草甘膦以及氨甲基膦酸標準品，用純水溶解配制成200 μg/mL標準儲備液，在4 ℃下保存待用。

標準曲線的配制：采用空白樣品（綠茶、大米、小麥粉、草莓、白蘿卜），經1.2提取凈化，配制成5個不同濃度基質標樣（5.00～100 μg/L和10.0～200 μg/L），現用現配。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的確立

草甘膦及其代謝產物氨甲基膦酸具有較強的極性，均具有易溶于水的特性，在水中能夠解離生成少量的氫離子，屬于較弱的有機酸，因此適合采用負離子源模式檢測，選擇ESI負離子模式對草甘膦和氨甲基膦酸進行母離子掃描（一級掃描），得到草甘膦和氨甲基膦酸的母離子，分別為167.8和109.9；然后再進行子離子掃描（二級掃描），得到的草甘膦的子離子（62.8和81.0），氨甲基膦酸的子離子為62.8和78.9；再對這些離子對進行碰撞電壓、去簇電壓、入口電壓和碰撞室出口電壓的優化，得到最佳的響應條件，見表2。最后對離子源溫度、噴霧電壓、氣簾氣流量、噴霧氣流量、輔助加熱氣流量進行優化，得到最佳的離子源參數：離子源溫度550 ℃；噴霧電壓-4 500 V；氣簾氣流量40.0 psi；噴霧氣流量60.0 psi；輔助加熱氣流量60.0 psi。

2.2 液相條件的選擇

質譜檢測雖然具有高的靈敏度和選擇性，但是對草甘膦和氨甲基膦酸的強極性和易溶于水的物質，需要選擇合適的色譜柱、流動相以及洗脫條件，使其具有尖銳對稱的峰型和一定的分離度，才能發揮出質譜的優勢。常規的C18和T3等色譜柱對草甘膦和氨甲基膦酸沒有保留，于是選擇HILIC模式色譜柱對其進行分離，氨基柱是HILIC模式中的一種，在糖類等碳水化合物分析中廣泛應用[19-20]，于是嘗試用它來分析，氨基柱常用的流動相是乙腈和水，由于草甘膦和氨甲基膦酸采用的是負離子模式，在流動相中可以添加適當濃度的氨水和乙酸銨來提高離子化效率而提高響應，同時改善色譜峰的峰型，緩沖體系進一步增加系統的穩定性，試驗發現乙酸銨的濃度為5 mmol/L，峰型尖銳對稱，又不會對檢測器造成太多的污染，故選擇5 mmol/L乙酸銨，當乙酸銨的濃度為5 mmol/L時，再添加不同濃度的氨水調節乙酸銨溶液的pH，草甘膦和氨甲基膦酸的響應與乙酸銨溶液pH的關系見圖1。結果顯示，pH越高，響應越好，這是因為在堿性條件下，草甘膦和氨甲基膦酸更容易形成[M-H]-準分子離子，但是考慮Waters BEH Amide氨基柱pH上限，最終確定乙酸銨溶液的pH為11。同時梯度洗脫有助于降低基質對目標化合物檢測干擾，同時可有效減少雜質對色譜柱的污染，獲得更好的分離效果和質譜響應，故選擇梯度洗脫。試驗得到的最佳液相條件為：色譜柱Waters BEH Amide氨基柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流速0.25 mL/min，流動相pH 11的5 mmol/L乙酸銨溶液和乙腈梯度洗脫，洗脫程序見表1。在該條件下進樣分析，草甘膦和氨甲基膦酸基質標準溶液的色譜圖見圖2，空白樣品的色譜圖見圖3，空白樣品添加回收的色譜圖見圖4。從圖2～圖4可以看出，優化后的液相條件可以得到尖銳對稱的峰型，無雜質干擾，可以進行準確的定量計算。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的峰面積與乙酸銨溶液的pH關系圖

圖2 草甘膦以及氨甲基膦酸基質標準溶液LC-MS-MS色譜圖

圖3 空白樣品的LC-MS-MS色譜圖

圖4 空白樣品添加回收的LC-MS-MS色譜圖

2.3 樣品的凈化

樣品用水提取后，首先通過二氯甲烷萃取除去脂溶性色素以及其他一些非極性雜質，然后再用固相萃取小柱進行凈化。Oasis HLB小柱的填料為親水親脂的反相吸附劑，可以有效去除蛋白質、脂肪、色素等物質，在抗生素[21]和激素[22]等檢測領域得到廣泛的應用，因此選擇Oasis HLB小柱作為凈化柱。分別將10.0和50.0 μg/L草甘膦和氨甲基膦酸標準溶液用HLB凈化，其回收率在93.8%～102%之間，說明HLB小柱對草甘膦和氨甲基膦酸沒有吸附，因此可以采取過濾式凈化模式，不需要清洗和洗脫步驟，操作簡單。對茶葉提取液過柱前后成分進行測定，發現過柱后茶多酚減少了95.2%，咖啡因減少了93.6%，氨基酸減少了62.6%，說明HLB小柱除了可以除去蛋白質、脂肪、色素等大分子物質，對一些小分子物質也有較好的除去效果，因此采取Oasis HLB固相萃取柱進行凈化。

2.4 方法的檢出限、定量限、線性范圍

方法檢出限（LOD）的確定通過空白樣品進行加標并不斷降低加標濃度，進樣分析信噪比為3，通過試驗和分析得到草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別為10.0和20.0 μg/kg。定量限（LOQ）的確定通過空白樣品進行加標并不斷降低加標濃度，進樣分析信噪比為10，并且回收率在70.0%以上，通過試驗和分析得到定量限分別為25.0和50.0 μg/kg。在1.3儀器條件下，草甘膦以及氨甲基膦酸分別在5.00～100 μg/L和10.0～200 μg/L質量濃度范圍內有良好的線性關系，綠茶、大米、小麥粉、草莓、白蘿卜五種基質標準曲線線性方程和相關系數見表3。

2.5 方法的準確度與精密度

方法的準確度通過空白樣品添加回收試驗的回收率來考察，添加濃度為定量限、2倍定量限和10倍定量限；精密度通過同一濃度平行添加6次回收率的相對標準偏差（RSD）來獲得，不同樣品基質回收率和相對標準偏差（RSD）的結果見表4。可以看出：該方法中草甘膦和氨甲基膦酸在各種基質中的回收率在72.0%～90.8%之間，精密度RSD值小于10.0%，符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范基本信息 食品理化檢測》中的回收率和精密度的要求。

表3 五種基質標準曲線線性方程和相關系數

表4 回收率和精密度試驗結果

3 實際樣品測定

運用此方法對市場上55份食品進行檢測，其中茶葉樣品22份、大米9份、小麥粉5份、水果12份、蔬菜7份結果顯示，茶葉樣品檢出5份，含量在0.062～1.31 mg/kg之間；水果樣品中草莓檢出1份，含量為1.45 mg/kg；大米檢出1份，含量為0.064 mg/kg。該方法可以滿足GB 2763—2016《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》對草甘膦的最大殘留量的規定，為食品中相關標準的修訂和制定提供借鑒意義。

4 結論

試驗通過采用水提取，HLB小柱凈化，氨基色柱進行分離，UPLC-MS/MS測定食品中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸。該方法簡便、快捷、有效，前處理步驟少，無需使用酸堿試劑調節pH，樣品無需衍生，結果準確性好，可滿足各類食品的檢測需求，具有一定的推廣價值。