轉(zhuǎn)cry1Ab/c水稻環(huán)介導(dǎo)等溫擴增快速檢測方法

王鎵璇，胡昱萱，吳海星，檀建新*

河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院（保定 071001）

轉(zhuǎn)基因作物（Genetically modified crops，GMC）是應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將已知的一種或幾種基因序列（DNA）構(gòu)建到載體上，將構(gòu)建好后的載體轉(zhuǎn)移到植物（如玉米、棉花、水稻等）細胞內(nèi)，從而實現(xiàn)基因重組，表達相應(yīng)的多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)物，得到轉(zhuǎn)基因作物[1]。轉(zhuǎn)基因作物根據(jù)其性能可分為4個種類：一是轉(zhuǎn)Bt農(nóng)作物[2]，可有效抵抗蟲害，同時減少農(nóng)藥使用和殘留；二是抗除草劑農(nóng)作物[3]，減輕除草劑對農(nóng)作物的危害；三是抗病毒農(nóng)作物，防治病毒侵害農(nóng)作物，從而增加其產(chǎn)量；四是營養(yǎng)增強型農(nóng)作物，其特定營養(yǎng)組分含量更高，其正成為飼料市場中越來越重要的部分[4]。在轉(zhuǎn)基因作物帶給人們革命性創(chuàng)新的同時，轉(zhuǎn)基因作物對于人體健康安全性和農(nóng)作物種植過程中對于環(huán)境安全性同樣引起各國的重視[5]。源于對其安全性的擔憂，市場廣泛需要建立一種簡便、靈敏的檢測作物中是否含有轉(zhuǎn)基因成分的方法。

目前國內(nèi)檢測轉(zhuǎn)基因成分的方法[6]主要分為以下幾種：一是以蛋白質(zhì)為標準的檢測技術(shù)，分為酶聯(lián)免疫吸附法[7]和蛋白質(zhì)印記雜交法[8]，蛋白質(zhì)在加工過程中容易變性，從而失去作為檢測指標的意義，影響試驗結(jié)果；二是基因芯片[9]和生物傳感器檢測方法[10]；三是近紅外光譜技術(shù)[11]；四是聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）方法[12]和LAMP方法。其中前三種方法技術(shù)要求高、儀器設(shè)備昂貴、實用性低。PCR方法需PCR儀，成本高、耗費時間長且靈敏度較低；相比較，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年開發(fā)的一種恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用一種鏈，置換DNA聚合酶，在恒溫條件短時間內(nèi)即可完成核酸擴增反應(yīng)，具有高靈敏度、強特異性、操作簡單等優(yōu)點[13]，該反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于微生物病原體的檢測[14]和進出口中轉(zhuǎn)基因食品的檢測中。此次試驗建立了以LAMP反應(yīng)為基礎(chǔ)的水稻中cry1Ab/c為目的基因快速檢測方法，以觀察濁度、電泳法、熒光染料法[15]三種方法進行結(jié)果分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻‘TT51-1’、抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻‘科豐六號’為天津市農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品檢驗與標準鑒定所保存；普通水稻‘4021-P6’‘9311’‘TP309-P6’由河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院劉麗娟老師惠贈。BstDNA聚合酶、10X Bst buffer、MgSO4，分析純，購自New England Bio Labs公司；dNTPs購自Solarbio公司；Taq酶Mix、DNA分子量Marker購自大連寶生物公司。

PCR儀，Biometra Co.，Ltd.；電泳儀，北京市六一儀器廠；紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；高速臺式離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，北京市六一儀器廠；電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；連續(xù)可調(diào)微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取

總基因的提取方法參考CTAB方法[16]。利用分光光度計測定所提取到的核酸在260～280 nm處的吸光度，確定其純度和濃度，將濃度調(diào)整為50 ng/μL，保存在-20 ℃，備用。按上述方法提取抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻TT51、抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻科豐六號，普通水稻‘4021-P6’‘9311’‘TP309-P6’的DNA，并調(diào)整濃度用作LAMP檢測cry1Ab/c特異性的模板；同時用分析天平為十萬分之一的規(guī)格稱取轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻，以一定的比例進行混合，使轉(zhuǎn)基因水稻占總質(zhì)量的2.5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%和0.005%，完全混勻，提取DNA，濃度統(tǒng)一調(diào)至50 ng/μL，用作LAMP檢測cry1Ab/c靈敏度的模板。

1.2.2 DNA模板質(zhì)量控制

為確定檢測結(jié)果是否可靠及準確，首先判斷待測樣品的內(nèi)標基因是否為水稻的蔗糖磷酸合酶（SPS基因，Genbank編號U33175），從而監(jiān)控提取的DNA質(zhì)量。PCR反應(yīng)水稻的內(nèi)標基因SPS是按照農(nóng)業(yè)部953號公告-6-2007進行擴增，正向引物SPS-F1的序列為：5’-TTGCGCCTGAACGGATAT-3’；反向引物SPS-R1序列為：5’-GGAGAAGCACTGGACGAGG-3’[17]。PCR擴增反應(yīng)體系共25 μL，包括上下游引物F3和B3各0.6 mmol/L，2.5 μL DNA模板，12.5 μL mix，用滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR反應(yīng)在PCR儀中進行，檢測水稻內(nèi)標準基因SPS的PCR反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性5 min，進入循環(huán)，94 ℃變性40 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃終延伸6 min；PCR擴增產(chǎn)物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 LAMP引物設(shè)計篩選與合成

使用來源于轉(zhuǎn)基因水稻外源基因Bt cry1Ab/c的人工改造序列，運用引物設(shè)計軟件Primer Explorer Version 4在線進行LAMP引物設(shè)計。篩選4條特異性引物：兩個外引物分別為上游外引物（F3）和下游外引物（B3）；兩個內(nèi)引物分別為上游內(nèi)引物（FIP）和下游內(nèi)引物（BIP），F(xiàn)IP由F1的互補序列和正向序列F2構(gòu)成，BIP由B1的互補序列和正向序列B2構(gòu)成。特異性引物所對應(yīng)的目的基因片段從358～575區(qū)域218 bp目的基因片段。引物由華大基因合成（見表1）。

表1 LAMP引物

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系

應(yīng)用的反應(yīng)體系共25 μL，包括有內(nèi)引物（FIP和BIP）各1 mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2 mmol/L，2.5 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L MgSO4，8 UBstDNA聚合酶，2 μL DNA模板，2.5 μL 10×Thermo Pol Buffer，用滅菌雙蒸水補足體系至25 μL。LAMP反應(yīng)過程：95 ℃變性5 min，65 ℃水浴反應(yīng)60 min，然后80 ℃ 10 min終止反應(yīng)。肉眼觀察其濁度變化，并高速離心后觀察管底部是否產(chǎn)生白色焦磷酸鎂沉淀。同時，取5 μL擴增產(chǎn)物，與1 μL 6×loading buffer混合均勻，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶是否正確，以證實LAMP反應(yīng)是否發(fā)生。也可直接加入SYBR Green Ⅰ觀察是否變?yōu)榫G色，判斷反應(yīng)是否發(fā)生。

1.2.5 PCR反應(yīng)體系

于PCR儀中進行PCR反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性5 min，然后進入循環(huán)，94 ℃變性40 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃終延伸6 min。結(jié)果檢測為5 μL PCR擴增產(chǎn)物，然后進行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP體系中所使用的不同濃度比的內(nèi)外引物于擴增反應(yīng)是最為重要的影響因素之一。固定外引物的濃度，改變內(nèi)引物的濃度，使外引物與內(nèi)引物的濃度比為1∶5，1∶6，1∶7和1∶8。dNTPs對擴增效率有顯著影響，為DNA合成提供原料和能量，在LAMP體系中dNTPs濃度梯度為0.7，0.8，0.9，1.0，1.1和1.2 mmol/L；LAMP反應(yīng)特殊之處是合成大量產(chǎn)物的同時，生產(chǎn)副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀。此次試驗反應(yīng)體DNA聚合酶的活性因子，其濃度對擴增的產(chǎn)量和特異性有顯著影響。濃度過低會降低DNA聚合酶活性，使產(chǎn)物量減少；而濃度過高，酶會催化非特異性擴增，反應(yīng)的特異性會降低。Mg2+的游離濃度又受到帶負電荷離子基團（如磷酸基團）的影響，因此反應(yīng)體系中應(yīng)不含帶負電荷離子基團，LAMP體系中磷酸根的主要來源dNTPs，其濃度的變化會影響Mg2+的濃度。因此在優(yōu)化反應(yīng)條件時，已將dNTPs的加入量設(shè)為1.0 mmol/L。此次試驗反應(yīng)體系中把Mg2+濃度依次設(shè)為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mmol/L。同時針對試驗中的反應(yīng)溫度進行探索，設(shè)為61，62，63，64，65和66 ℃。

1.2.7 LAMP反應(yīng)的靈敏度和特異性檢測

以1.2.1提取的DNA模板分別做LAMP和PCR擴增，擴增后分別取5 μL反應(yīng)物進行凝膠電泳，向剩余的反應(yīng)物中加入1 μL 100倍SYBR Green Ⅰ熒光染料，充分混勻，觀察顏色變化。SYBR Green Ⅰ是一種直接與dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域非特異性結(jié)合后具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green Ⅰ發(fā)出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結(jié)合，熒光會增強1 000倍，如果發(fā)生了擴增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后混合液會由橙色變?yōu)榫G色；如果未發(fā)生反應(yīng)，則反應(yīng)結(jié)束后混合液的顏色仍保持SYBR Green Ⅰ的橙色不變。試驗采用凝膠電泳法和熒光染料法顯示LAMP擴增和PCR擴增的靈敏度和特異性結(jié)果，并對LAMP和PCR法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻模板DNA質(zhì)量控制

以‘TT51-1’轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻DNA為模板，對SPS水稻內(nèi)標基因進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。轉(zhuǎn)基因水稻和非轉(zhuǎn)基因水稻均擴增出大小為277 bp的明顯條帶，與目的產(chǎn)物片段大小一致，可作為進一步檢測應(yīng)用的模板。

圖1 水稻基因組SPS基因PCR檢測

2.2 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果見圖2～圖5。由圖2可知，反應(yīng)溫度在61～66 ℃區(qū)間對反應(yīng)影響不大，最終選擇為65 ℃；圖3表明dNTPs濃度在1.0～1.2 mmol/L范圍內(nèi)效果相當，最終選擇1.0 mmol/L；圖4顯示LAMP反應(yīng)的內(nèi)外引物比例在1∶5時條帶最亮，因此選擇內(nèi)外引物比例為1∶5；圖5證明LAMP反應(yīng)的最佳Mg2+濃度為0.5 mmol/L，由此確立上述參數(shù)為最佳LAMP反應(yīng)體系。

圖2 LAMP反應(yīng)溫度的優(yōu)化

圖3 LAMP反應(yīng)體系中dNTPs濃度優(yōu)化

圖4 LAMP反應(yīng)體系中內(nèi)外引物比例的優(yōu)化

圖5 LAMP反應(yīng)體系中Mg2+濃度的優(yōu)化

2.3 LAMP法檢測cry1Ab/c的靈敏度

LAMP擴增和PCR擴增電泳結(jié)果見圖6（A）和圖6（B）。

圖6 LAMP法和PCR法的檢測靈敏度

由圖6（A）可見，泳道1～5均出現(xiàn)LAMP反應(yīng)特有的階梯狀電泳條帶，最低檢測限可以達到0.05%；由圖6（B）可見，泳道1～3常規(guī)PCR均擴增出218 bp大小的特異性條帶，PCR只能擴增濃度在0.5%以上的樣品。電泳結(jié)果顯示，此次試驗所建立的LAMP方法的靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。熒光染料檢測結(jié)果（圖6C）與凝膠電泳法LAMP擴增結(jié)果一致。

2.4 LAMP法檢測cry1Ab/c的特異性

LAMP法和PCR法測定特異性結(jié)果見圖7。

圖7 LAMP法和PCR法的特異性

熒光染料法結(jié)果（圖7C）顯示科豐六號反應(yīng)管呈綠色，與陽性反應(yīng)管轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1結(jié)果一致，表明出現(xiàn)大量擴增產(chǎn)物，為cry1Ab/c陽性結(jié)果。非轉(zhuǎn)基因水稻4021-P6、9311、TP 309-P6的反應(yīng)管呈淺橙色，與空白對照反應(yīng)管可視結(jié)果一致，表明引物未能與模板配對擴增，無產(chǎn)物生成，為cry1Ab/c陰性結(jié)果。凝膠電泳分析（圖7A和圖7B）結(jié)果顯示科豐六號有明顯階梯狀條帶，與陽性對照TT51-1完全相同。其余三個樣品無條帶出現(xiàn)，與空白對照結(jié)果一致，該電泳結(jié)果與LAMP擴增后直接加入SYBR GREEN I熒光染料的結(jié)果是一致的。

3 討論與結(jié)論

用LAMP法檢測水稻中是否含有轉(zhuǎn)基因成分需要以下四方面的準備：第一，分析檢測水稻中插入的改造后crylAb/c基因的序列；第二，從轉(zhuǎn)基因水稻中提取DNA來作為反應(yīng)的模板；第三，針對該水稻品種設(shè)計4條特異性引物；最后，優(yōu)化該法中一系列有關(guān)反應(yīng)條件，得到最優(yōu)用于檢測的反應(yīng)體系。此次試驗對象為轉(zhuǎn)基因水稻，以其內(nèi)標準基因SPS基因為靶基因，根據(jù)文獻合成特定引物，建立了以內(nèi)標準基因SPS基因能否實現(xiàn)PCR擴增來判斷從水稻中提取模板DNA質(zhì)量優(yōu)劣的方法。同樣運用引物設(shè)計軟件設(shè)計出針對crylAb/c基因的LAMP特異性引物。通過優(yōu)化影響LAMP反應(yīng)的各種因素，確立了快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻的LAMP反應(yīng)體系：Mg2+濃度為0.5 mmol/L，dNTPs濃度為1.0 mmol/L，上、下游內(nèi)引物FIP、BIP濃度均為1 mmol/L，上、下游外引物F3、B3濃度均為0.2 mmol/L，8 U Bst DNA聚合酶大片段的添加量為0.7 μL，模板DNA濃度為50 ng/μL，反應(yīng)溫度為65 ℃，反應(yīng)時間為60 min。采用上述建立的優(yōu)化后LAMP體系進行靈敏度試驗，以PCR方法作對比試驗，結(jié)果顯示LAMP方法最低檢測限度可以達到0.05%，而PCR方法最低檢測限在0.5%，即LAMP方法檢出限比傳統(tǒng)PCR法低10倍。用LAMP法對轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因水稻進行特異性檢測，電泳結(jié)果與熒光呈色結(jié)果一致。LAMP法比PCR法檢測更方便快捷，體現(xiàn)在擴增時間更短（LAMP法只需60 min；PCR需100 min）、儀器設(shè)備簡單（LAMP法只需用恒溫水浴鍋在恒溫條件下即可擴增；PCR法需昂貴的PCR儀，并且反復(fù)變性實現(xiàn)擴增）、結(jié)果檢測更方便（LAMP法可以直接添加SYBR Green Ⅰ熒光染料，通過可視結(jié)果判斷；PCR法通過普通的瓊脂糖凝膠電泳法，時間比前者長且操作時會接觸具有致癌性的EB，一定程度上有潛在的風險危害）、檢測靈敏度更高?；谝陨弦幌盗械娘@著特性，運用LAMP法對轉(zhuǎn)基因水稻快速檢測有較強的優(yōu)越性、可操作性、簡便性，在市場或基層試驗中有著較為廣泛的應(yīng)用前景。