海藻酸鈉-乳清蛋白復合包埋益生菌及特性

周莉，王曉瑞，譚靜，平洋，徐鐘*

河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司（鄭州 450002）

益生菌具有卓越的益生功效[1]，不僅有利于維持腸道菌群平衡[2]，增強胃腸道黏膜屏障[3]，而且能夠調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[4]，預防癌癥[5]，降低膽固醇[6]，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[7-8]。然而，益生菌對人體的保健效果與其到達腸道的菌活密切相關。胃腸道環(huán)境中的多種不良因素，尤其是胃酸，會使益生菌的活菌數(shù)量顯著下降，明顯限制其益生功能的發(fā)揮[9]。益生菌如果未經(jīng)改造，生命力十分脆弱，是無法耐久存的，利用微膠囊技術，通過一定手段將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中[10]，不僅能在加工或儲藏過程中提高益生菌的有效活菌數(shù)，還能在通過胃腸道期間對益生菌進行保護，使其以較少的活性損失到達腸道靶位點[11]，可有效增強菌體對消化道逆環(huán)境的抵抗力，并將益生菌在適當?shù)奈恢冕尫牛l(fā)揮其益生作用[12-13]。

試驗擬制備海藻酸鈉和乳清蛋白雙層復合包埋益生菌微膠囊。以乳清蛋白包裹菌體形成營養(yǎng)保護層，與具有良好生物相容性和腸溶性的海藻酸鈉發(fā)生交聯(lián)凝聚發(fā)應，形成在胃中不消化、耐酸性能更好的雙層微膠囊。該雙層微膠囊即可發(fā)揮乳清蛋白高營養(yǎng)價值、網(wǎng)絡鎖水功能和對于益生菌的活性保護作用[14]，又可利用外層凝膠避免其在胃中水解。雙層包埋的益生菌比單層包埋益生菌更能抵御胃液的侵害。將乳清蛋白與海藻酸鈉作為益生菌的包埋壁材，為益生菌的包埋研究提供依據(jù)，可以解決益生菌制劑在生產(chǎn)、使用過程中活性、數(shù)量及效價損失嚴重的問題，具有廣泛的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MRS肉湯、MRS培養(yǎng)基、莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂（青島海博）；兩歧雙歧桿菌（廣東環(huán)凱，本實驗室傳代保存）；胃蛋白酶、胰蛋白酶（Biofroxx）；海藻酸鈉、乳清蛋白（80%）（源葉生物）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈣、氯化鈉、鹽酸（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 儀器與設備

YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱、DPX-9162B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海福瑪實驗設備有限公司）；YXQ-LS-50型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）；85-2恒溫磁力攪拌器（海司樂儀器有限公司）；UNIVERSAL 320R型高速離心機（德國Hettich公司）；QL-866型旋渦振蕩器（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；BSC-1500ⅡB2-X型生物安全柜（鑫貝西Biobase）；SHZ-82型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；HH-S恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療器械廠）；700 Series型-80 ℃冰箱（中科美菱）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；Milli-Q超純水儀（美國Milipore）。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化培養(yǎng)

將保存的兩歧雙歧桿菌接種于MRS肉湯中，于37℃恒溫厭氧培養(yǎng)24 h，將植物乳桿菌、干酪乳桿菌接種于MRS肉湯中，于37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)18 h，并根據(jù)2%接種量接種，連續(xù)活化傳代2～3次。以6 000 r/min離心5 min，用0.85%無菌生理鹽水洗滌2次，重懸于生理鹽水中，使此濃縮菌液為109CFU/mL。利用平板計數(shù)法對濃縮菌液進行精確計數(shù)。

1.3.2 益生菌微膠囊的制備[15]

稱取一定質(zhì)量的海藻酸鈉粉末溶于滅菌水中，70℃下水浴加熱過夜至粉末充分溶解，制得海藻酸鈉溶液，并經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾除菌，冷卻備用。稱取一定質(zhì)量的乳清蛋白粉末，溶于含有質(zhì)量分數(shù)1%鹽酸的無菌水中，在磁力攪拌器上攪拌直至溶解完全。使用磁力攪拌器在800 r/min下，攪拌懸浮1 h后備用。

稱取一定質(zhì)量的氯化鈣顆粒溶于雙蒸水，以121℃高壓滅菌15 min，制得氯化鈣溶液，將菌液、乳清蛋白和海藻酸鈉以一定的比例混合，用注射器將10 mL混合液滴入100 mL CaCl2固化劑中，形成微囊，磁力攪拌器攪拌30 min，使微囊充分凝固，用蒸餾水沖洗3次，除去多余的鈣離子和未被包埋的益生菌，即得濕膠囊。

1.3.3 微膠囊包埋率的測定

準確稱取1 g濕微膠囊樣品，加入9 mL解囊液中[PBS緩沖液（pH 7.4）][16]，振搖10 min至完全解囊。將梯度稀釋后涂布于MRS瓊脂上，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h并計數(shù)。微膠囊的包埋率計算公式：

包埋率=微膠囊中包埋的活菌數(shù)/制備微膠囊時添加的活菌數(shù)×100% （1）

1.3.4 益生菌微膠囊制備工藝優(yōu)化

通過單因素試驗測定不同海藻酸鈉濃度（1%，2%，3%，5%和8%）、乳清蛋白濃度（3%，5%，8%，10%和12%）、氯化鈣濃度（1%，2%，3%，5%和8%）和攪拌速度（200，400，600，800和1 000 r/min）對復合益生菌微膠囊的影響。采用四因素三水平L9(34)正交試驗設計，研究4個因素對微膠囊包埋率的影響。正交試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表

1.3.4.1 海藻酸鈉最佳濃度的確定

在乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，海藻酸鈉濃度1%，2%，3%，5%和8%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測定指標，探究海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響，以確定海藻酸鈉的最佳濃度。

1.3.4.2 乳清蛋白最佳濃度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，攪拌速度800 r/min，乳清蛋白濃度3%，5%，8%，10%和12%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測定指標，探究乳清蛋白濃度對微膠囊包埋率的影響，以確定乳清蛋白的最佳濃度。

1.3.4.3 氯化鈣最佳濃度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度1%，2%，3%，5%和8%的條件下，參照微膠囊的制備工藝制得微膠囊后，以微膠囊的包埋率為測定指標，探究氯化鈣濃度對微膠囊包埋率的影響，以確定氯化鈣的最佳濃度。

1.3.4.4 攪拌速度的確定

在海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%的條件下，參照微膠囊的制備工藝形成微囊后，然后用磁力攪拌器攪拌，攪拌速度為200，400，600，800和1 000 r/min，過濾，并用蒸餾水將膠囊沖洗3次，即得濕膠囊。以微膠囊的包埋率為測定指標。

1.3.5 益生菌微膠囊在模擬胃液中的耐受性

模擬人工胃液[17]：取16.4 mL稀鹽酸，加約800 mL水，調(diào)pH至2.0，加10 g胃蛋白酶，攪勻后加水定容至1 000 mL即可。

取0.5 g微膠囊加入到模擬胃液（4.5 mL）中，充分混勻15 s，在37 ℃條件下，以200 r/min在搖床中振蕩處理30，60，90，120和150 min，分別離心收集取樣，活菌計數(shù)。同時進行對照試驗。

1.3.6 益生菌微膠囊在模擬腸液中的釋放性

模擬人工腸液[18]：取6.8 g磷酸二氫鉀，加500 mL水。用0.4%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 6.8；另取10 g胰蛋白酶，加適量水使其溶解，將兩液混合后，加水定容至1 000 mL即可。

取0.5 g微膠囊加入到模擬腸液（4.5 mL）中，充分混勻15 s，在37 ℃條件下，以200 r/min在搖床中振蕩處理30，60，90，120和150 min，分別離心收集取樣，活菌計數(shù)。同時進行對照試驗。

1.3.7 益生菌膠囊產(chǎn)品儲藏穩(wěn)定性

將最佳工藝條件下包埋的兩歧雙歧桿菌益生菌微膠囊置于4 ℃條件下進行保藏，每隔7 d取樣計活菌數(shù)，檢測微膠囊的穩(wěn)定性。相同條件下取未被包埋的兩歧雙歧桿菌置于4 ℃條件下進行保藏，每隔7 d取樣計活菌數(shù)。

2 結(jié)果及討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 海藻酸鈉濃度對益生菌微膠囊的影響

試驗中，保持乳清蛋白濃度10%、氯化鈣濃度2%，在海藻酸鈉濃度1%，2%，3%，5%和8%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖1。在一定范圍內(nèi)，包埋率隨海藻酸鈉濃度的加大而增大，海藻酸鈉濃度3%時，包埋率達到最大。海藻酸鈉繼續(xù)增大時，包埋率降低。這是由于海藻酸鈉濃度高時，溶液黏度增大，益生菌不易分散；海藻酸鈉濃度低時，形成的凝膠顆粒小，機械強度低，不能有效包埋菌體，影響包埋效果。因此，以海藻酸鈉濃度3%作為后續(xù)試驗條件。

圖1 海藻酸鈉濃度對微膠囊包埋率的影響

2.1.2 乳清蛋白濃度對益生菌微膠囊的影響

保持海藻酸鈉濃度3%、氯化鈣濃度2%，乳清蛋白濃度3%，5%，8%，10%和12%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖2。乳清蛋白濃度10%時，微膠囊所包埋的菌落數(shù)最多，包埋的效果最好。乳清蛋白濃度小于10%時，隨著乳清蛋白濃度的升高，包埋率也增大；海藻酸鈉濃度大于10%時，包埋率反而降低。可能由于，隨著乳清蛋白濃度的增大，乳清蛋白與海藻酸鈉結(jié)合越來越緊密，對包埋物質(zhì)擴散的抑制作用增強，包埋率增加。乳清蛋白濃度增大到12%，對減少包埋過程中的損失減少，對包埋率影響較弱。

2.1.3 氯化鈣濃度對益生菌微膠囊的影響

試驗中，保持海藻酸鈉濃度3%、乳清蛋白濃度10%，在氯化鈣濃度1%，2%，3%，5%和8%條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖3。氯化鈣濃度小于2%時，隨著氯化鈣濃度的升高，包埋率也增大，氯化鈣濃度2%時，包埋率達到最大值。

圖2 乳清蛋白濃度對微膠囊包埋率的影響

圖3 氯化鈣濃度對微膠囊包埋率的影響

2.1.4 攪拌速率對益生菌微膠囊的影響

試驗中，在海藻酸鈉濃度3%、乳清蛋白濃度10%、氯化鈣濃度2%，攪拌速度200，400，600，800和1 000 r/min條件下制備微膠囊，所制備的微膠囊性質(zhì)見圖4。攪拌速率的不同，菌體的包埋率也不盡相同，攪拌速率800 r/min時的包埋率最大，攪拌速率200 r/min時的包埋率最小。在不改變其他試驗工藝條件下，攪拌速度的逐漸增加會導致微膠囊的包埋率出現(xiàn)先升高后降低的情況。攪拌速度800 r/min時，包埋率為78%，與其他試驗組有明顯差異性。

圖4 攪拌速率對微膠囊包埋率的影響

2.2 正交優(yōu)化

以單因素試驗中獲得的最適條件為基礎，進行正交試驗，考察海藻酸鈉、乳清蛋白、氯化鈣濃度和攪拌速度等參數(shù)對益生菌微膠囊包埋效果的影響，所得結(jié)果如表3所示。

單因素分析規(guī)律是試驗因素對指標的影響呈正相關，極差順序比較依次為：海藻酸鈉濃度（A）＞乳清蛋白濃度（B）＞氯化鈣濃度（C）＞攪拌速度（D）。所以正交試驗下得出的海藻酸鈉濃度對益生菌微膠囊的包埋率影響最大，為最重要的影響因素，其次是乳清蛋白，然后是氯化鈣，最后是攪拌速度。理論上的最佳組合為A2B3C1D3。即海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，攪拌速度800 r/min。

表2 正交試驗結(jié)果表

2.3 兩歧雙歧桿菌益生菌微膠囊在模擬胃液中的存活率

未經(jīng)包埋的兩歧雙歧桿菌在模擬胃液中150 min基本全部死亡，兩歧雙歧桿菌對外界環(huán)境敏感，胃液中的低酸環(huán)境使得未經(jīng)處理的兩歧雙歧桿菌細胞難以存活。相比于未經(jīng)包埋的兩歧雙歧桿菌，雙層包埋能夠顯著地提高益生菌在模擬胃液中的存活率。雙層包埋的兩歧雙歧桿菌在經(jīng)過150 min的人工胃液處理后，存活率達到70%以上，說明雙層包埋對保護兩歧雙歧桿菌耐胃酸效果較好。

圖5 微膠囊在模擬胃液中的存活情況

2.4 益生菌微膠囊在模擬腸液中的釋放性

隨著微膠囊在人工腸液處理的時間延長，微膠囊包埋的兩歧雙歧桿菌會連續(xù)釋放，其在人工腸液處理中處理60 min之后，菌體的存活率變化不大，在9 log CFU/mL左右，表明試驗的微膠囊腸液溶性較好，60 min之后，兩歧雙歧桿菌就會被連續(xù)地釋放出來，為膠囊能靶向地產(chǎn)生益生效果鋪墊基礎。

圖6 微膠囊在模擬腸液中的釋放情況

2.5 益生菌微膠囊產(chǎn)品儲藏穩(wěn)定性

將益生菌微膠囊置于4 ℃條件下進行保藏，每隔7 d取樣計活菌數(shù)，經(jīng)微膠囊技術包埋的兩歧雙歧桿菌和未包埋的兩歧雙歧桿菌活菌數(shù)會隨著儲藏時間的延長而呈現(xiàn)下降趨勢。由于經(jīng)過微膠囊化處理，兩歧雙歧桿菌外面包覆一層高分子囊膜，使其與外界環(huán)境隔離，增強了對不良環(huán)境的抵抗力，在儲藏過程中不易失去活性，故菌體存活率較高，膠囊的貯存穩(wěn)定性較好。微膠囊技術明顯地提高兩歧雙歧桿菌的儲藏穩(wěn)定性。

圖7 益生菌微膠囊4 ℃的儲藏試驗

3 結(jié)論

研究利用海藻酸鈉和乳清蛋白復合包埋技術，能夠高效地包埋益生菌。以包埋率為指標，通過優(yōu)化制備條件，海藻酸鈉濃度3%，乳清蛋白濃度10%，氯化鈣濃度2%，攪拌速度800 r/min，在此條件下包埋率達到78.0%±2.0%。制備的微膠囊在胃液中具有良好耐酸性，在腸液中具有良好釋放性，并且具有貯存穩(wěn)定性，有助于解決益生菌不耐胃酸與不易保存的問題。試驗結(jié)果不僅可以提高益生菌在應用過程中的菌體存活率，而且為益生菌微膠囊的工藝優(yōu)化提供理論和實踐依據(jù)。