黑虎掌菌多糖脫色工藝及其抗氧化活性

冉靚，周嬋媛，張桂玲，李素蓮，蒙進蘭

1. 貴陽學院化學與材料工程學院（貴陽 550005）；2. 核工業240研究所（沈陽 110000）

黑虎掌菌（Sarcodon aspratum（Berk.）S. Ito）是一種分布于我國云南、四川、西藏、貴州等地的食用真菌。營養學的研究表明，該菌營養較為均衡，含有人體所需的8種必需氨基酸和Mg、Mn、Fe、Zn等多種礦物質元素[1]。化學成分的研究顯示，新鮮黑虎掌菌中含有腦苷脂、核苷、多羥基麥角甾醇等化合物，脂肪烴醇類、芳香性雜環類等42種揮發性芳香物質，其精油中含有2-甲基-己酸等77種化學成分[2-5]。相關研究提示，黑虎掌菌有抗腫瘤、抗菌、抗氧化、提高免疫力等多種生物學活性[6-9]。近年來，多糖作為一種生物活性大分子而備受關注，有研究者對黑虎掌菌多糖的提取工藝、結構組成、活性等開展了不少研究[10-12]，但對其多糖純化工藝的研究報道較少，而純度是影響多糖產品質量的關鍵因素之一，因此，試驗針對黑虎掌菌多糖純化過程中的脫色環節進行了相關研究，通過正交試驗優化黑虎掌菌多糖的樹脂脫色工藝，并與其他脫色方案進行比較，同時比較脫色前后樣品的總抗氧化能力，以期為黑虎掌菌多糖的純化和體外抗氧化活性研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

黑虎掌菌（貴州聚特工貿有限公司）。

葡萄糖、無水乙醇、重蒸苯酚、濃硫酸、雙氧水（30%）、鹽酸、氫氧化鈉等，以上試劑均為分析純，試驗用水為去離子水。

大孔吸附樹脂：D101、HPD 450、HPD 600；大孔陽離子交換樹脂：D001、D113；大孔陰離子交換樹脂：D202、D301。

1.2 主要儀器與設備

FZ102粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；RE-52旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SC-3616低速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；101-2AB電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHA-B恒溫震蕩器（常州澳華儀器有限公司）；FA1104電子天平（上海舜宇恒平科技儀器有限公司）；Blue Star A紫外可見分光光度計（北京萊伯泰科技儀器股份有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑虎掌菌多糖的制備

稱取適量黑虎掌菌干品，于80 ℃水浴中，以20∶1（mL/g）的液料比，提取兩次。合并濾液，濃縮后，加無水乙醇至濃縮液中，使混合液中乙醇體積分數達到80%以上，靜置過夜后離心，收集沉淀，在60 ℃下真空干燥沉淀，得黑虎掌菌粗多糖。

1.3.2 測定方法

1.3.2.1 多糖保留率的測定

用硫酸-苯酚法測定脫色前后樣品溶液中的總糖含量，按式（1）計算多糖保留率[13]。

1.3.2.2 脫色率的測定

在200～800 nm波長處對黑虎掌菌多糖溶液進行掃描，確定360 nm為后續測定波長，在該波長下研究溶液的脫色情況，按式（2）計算脫色率[14]。

1.3.3 大孔樹脂的篩選

1.3.3.1 樹脂的預處理

按文獻[15]將樹脂進行預處理，備用。

1.3.3.2 樹脂的篩選

配制1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，按10∶1（mL/g）的液料比加入預處理好的樹脂，在25 ℃，200 r/min條件下振蕩24 h，取上清液，過濾后用1.3.2的方法測定。

1.3.4 優選樹脂的脫色優化試驗

1.3.4.1 單因素試驗

選取樹脂加入量、溫度、時間、樣品質量濃度、樣品pH為考察對象，每次試驗時，固定其中四個因素，研究剩余因素在不同水平下的試驗結果，用1.3.2的方法測定。

樹脂加入量對脫色效果的影響：分別稱取40.0，20.0，10.0，5.0和2.5 g處理后的D202樹脂，加入100.0 mL質量濃度為1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖樣品溶液中，在100 r/min，30 ℃下振蕩脫色2 h。

溫度對脫色效果的影響：稱取5.0 g處理好的D202樹脂，加入50.0 mL質量濃度為1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，分別在20，30，40，50，60，70和80 ℃的恒溫水浴中振蕩2 h。

時間對脫色效果的影響：稱取5.0 g處理好的D202樹脂，加入50.0 mL質量濃度為1.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，分別置于30 ℃，100 r/min條件下1，2，3，4和5 h。

樣品質量濃度對脫色效果的影響：分別稱取5.0 g干燥后的樹脂，加入質量濃度為0.5，1.0，2.0，4.0和8.0 mg/mL的多糖溶液中，在30 ℃，100 r/min的條件下，振蕩脫色2 h。

樣品pH對脫色效果的影響：分別稱取5.0 g樹脂，加入50.0 mL pH 3.00，5.00，7.22（原始溶液pH），9.00和11.00的1.0 mg/mL黑虎掌菌多糖溶液中，在30℃，100 r/min下振蕩脫色2 h。

1.3.4.2 正交試驗[16]

在單因素試驗結果基礎上，優選因素水平，依據L9(34)表進行試驗，用1.3.2的方法測定，按綜合評分=脫色率×0.5+多糖保留率×0.5進行計算，根據結果進行工藝優化。

1.3.4.3 驗證試驗

根據正交試驗結果進行驗證試驗，平行3次。

1.3.5 不同脫色方案的比較試驗

采用3種不同脫色方案對黑虎掌菌多糖溶液進行脫色，以綜合評分為評價指標，采用最小顯著性法（LSD法）進行多重比較分析。

1.3.5.1 樹脂法脫色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，按優化條件進行試驗，用1.3.2的方法測定。

1.3.5.2 活性炭脫色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，每份30.0 mL，分別加入3.0 g顆粒活性炭，置于60 ℃，100 r/min的水浴恒溫振蕩器中，振蕩3 h后取出，用1.3.2的方法測定[17]。

1.3.5.3 雙氧水脫色

取3份4.0 mg/mL的黑虎掌菌多糖溶液，每份25.0 mL，分別加入10.0 mL 30%的雙氧水，置于60 ℃，100 r/min的水浴恒溫振蕩器中，振蕩3 h后取出，用1.3.2 的方法測定[18]。

1.3.6 樣品脫色前后的抗氧化性試驗

采用脫色、醇沉工藝制備脫色后樣品，采用FRAP法評價脫色前后黑虎掌菌多糖的抗氧化活性[19]。

2 結果與分析

2.1 篩選樹脂結果

用1.3.3.2中的方法對7種不同類型樹脂進行篩選，結果如表1所示。僅就脫色率而言，在所有樹脂中，陽離子交換樹脂（D001、D113）的脫色效果最差，陰離子交換樹脂（D202和D301）和大孔吸附樹脂（D101，HPD 450和HPD 600）的脫色效果相當，說明采用吸附的原理或離子交換的原理，樣品中的色素有較好的去除。但是，結合多糖保留率考慮，發現離子交換的選擇性優于吸附，所以陰離子交換樹脂比大孔吸附樹脂對多糖的保留情況整體較好。綜合考慮，優選D202對黑虎掌菌多糖溶液進行脫色。

表1 不同樹脂脫色效果比較

2.2 樹脂法脫色的優化試驗結果

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 樹脂加入量對脫色效果的影響

由圖1可見，隨著樹脂加入量的增加，溶液脫色程度呈明顯增大趨勢，由39.80%增加到92.06%，但是多糖的保留率卻隨著該比值的增大而逐漸下降，由90.64%下降到49.09%；在20～40 g/100 mL之間，脫色率和多糖保留率的變化均較為平緩。綜合考慮，可將10 g/100 mL的樹脂加入量固定為后續試驗的條件。

圖1 樹脂加入量對脫色效果的影響

2.2.1.2 溫度對脫色效果的影響

由圖2可知，樣品溶液的脫色程度隨著溫度的增加而逐漸升高，由64.84%增加到90.16%；而多糖保留率隨溫度的改變而變化較大，其中在60，50和40 ℃這3個溫度下，多糖的保留率均較高，而在高溫條件下，多糖保留率較低，這可能與多糖在高溫下的穩定性有關。綜合分析，可將60 ℃固定為后續試驗的條件。

2.2.1.3 時間對脫色效果的影響

由圖3可知，隨著時間的延長，黑虎掌菌多糖溶液的脫色率增大，由75.27%增加到86.84%，而多糖的保留率卻減小到45.81%。在1～3 h內，樹脂對色素的吸附呈一定增加的趨勢，而多糖的保留程度也較好。故選擇1，2和3 h作為正交試驗的3個水平點。

2.2.1.4 樣品質量濃度對脫色效果的影響

由圖4可見，隨著黑虎掌菌多糖溶液濃度的升高，脫色程度逐漸增大，說明濃度對脫色有一定的影響。在1.0，2.0和4.0 mg/mL這3個濃度下，脫色效果比較好，多糖的保留率也較大，為66.35～93.29%。因此，可以選擇1.0，2.0和4.0 mg/mL這3個濃度作為正交試驗的3個水平。

圖2 溫度對脫色效果的影響

圖3 時間對脫色效果的影響

圖4 樣品質量濃度對脫色效果的影響

2.2.1.5 樣品pH對脫色效果的影響

由圖5可見，脫色率曲線隨pH變化的波動比較大，D202在過酸和過堿的情況下對色素的吸附能力明顯減弱。在pH為5.00，7.22和9.00這3個條件下脫色率均較大，多糖的保留率也相對較高，所以選擇pH為5.00，7.22和9.00作為正交試驗的3個水平點。

2.2.2 正交試驗及驗證試驗結果

根據單因素試驗的結果，采用L9(34)表安排試驗，試驗結果如表2和表3所示。根據方差分析的結果，該模型非常顯著，各因素對黑虎掌菌多糖脫色效果的影響次序為：試樣質量濃度＞pH＞時間，其中試樣質量濃度和pH的影響非常顯著。多糖脫色的優化工藝條件為：多糖質量濃度4.0 mg/mL，多糖溶液pH 9.00，時間3 h。按此優化條件進行驗證試驗，平行3組，多糖脫色率為91.75%±0.70%，多糖保留率為55.84%±6.64%。

圖5 樣品pH對脫色效果的影響

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.3 不同脫色方案的比較試驗結果

借助1.3.5的方法比較不同脫色方案處理黑虎掌菌多糖的效果，經LSD法分析，結果如表4所示。樹脂法與活性炭法、過氧化氫法比較，它們對樣品的脫色處理有顯著差異（p＜0.05），而活性炭法和過氧化氫法的處理效果在統計學上無明顯差異，三種脫色方案的優劣順序為：樹脂法＞活性炭法＞過氧化氫法。

表4 三種脫色方案的結果比較（n=3）

2.4 樣品抗氧化性試驗結果

按1.3.6中的方法進行試驗，結果如圖6所示。在樣品濃度為0.5～2.5 mg/mL的范圍內，脫色前后的黑虎掌菌多糖均表現出抗氧化性，且兩個樣品的抗氧化能力均呈現出一定的量效關系，脫色前多糖樣品的抗氧化性略強。

圖6 樣品抗氧化性試驗結果

3 結論與討論

此次試驗對黑虎掌菌多糖的脫色工藝進行了優化，并比較了多糖在脫色前后抗氧化性能的差異，結果顯示：

1) 用不同類型的大孔樹脂對黑虎掌菌多糖進行脫色處理，均能表現出脫色效果，但效果有差異。這種差異可能與樹脂的作用原理不同有關，不同極性的大孔吸附樹脂主要基于極性不同進行物理吸附，而離子交換樹脂對物質的吸附主要源于離子交換。此次試驗中，樣品的色素主要帶有負電荷，故所選的7種樹脂中，陰離子交換樹脂的選擇性更好，整體表現較好，D202樹脂對試驗樣品的脫色率可達75.45%，多糖保留率為69.91%，整體效果較佳。

2) 用D202樹脂對黑虎掌菌多糖脫色的最佳工藝條件為：溫度60 ℃，樹脂加入量10 g/100 mL，多糖溶液pH 9.00，質量濃度4.0 mg/mL，時間3 h。此條件下的多糖脫色率為91.75%±0.70%，多糖保留率為55.84%±6.64%。結果說明，樹脂對多糖的脫色過程，從動態平衡的角度考慮，受傳統熱力學因素的影響，但不能忽略樣品中目標成分在相關條件下的穩定性，同時還需結合樹脂作用的原理考慮，設置有利于樹脂發揮作用的試驗條件。

3) 對比了3種脫色方案（過氧化氫法、活性炭法、樹脂法）對黑虎掌菌多糖的處理效果，綜合評分法表明樹脂法明顯優于過氧化氫法和活性炭法。這可能是因為此次試驗中所選用樹脂的選擇性相對較高，而過氧化氫法主要是化學氧化脫色，活性炭法主要是物理吸附脫色，這兩種方式雖然能夠去除色素等雜質，但也能較大程度地影響樣品中的目標成分多糖。

4) 脫色前后的黑虎掌菌多糖均有一定的抗氧化活性。該結果在一定程度上說明此次試驗中色素成分對樣品的抗氧化性貢獻較小，黑虎掌菌多糖本身具有抗氧化活性，但具體作用的機制和方式需要進一步試驗的研究。

綜上所述，D202可用于黑虎掌菌多糖的脫色處理，該方法對儀器設備要求較低，工藝條件溫和，脫色率較高，多糖損失較少，且脫色前后樣品的抗氧化活性變化較小，能夠在一定程度上改善黑虎掌菌多糖的品質，便于該樣品的后續研究。