藜麥酵素的制備工藝及活性

雨田*，胡一晨，彭鐮心，鄒亮，趙鋼，孫佑玲

1. 成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院（護(hù)理學(xué)院）（成都 610106）；2. 成都大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（成都 610106）；3. 成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院（成都 610106）

藜麥（Chenopodium quinoaWilld.）為莧科藜屬植物[1]，營養(yǎng)成分豐富，是古印加人的傳統(tǒng)糧食作物。藜麥具有一些谷類作物特性，但它不含麩質(zhì)，適合對麩質(zhì)過敏人群食用[2]。此外，大量研究表明，藜麥含有較多多酚、黃酮、皂苷、多糖、多肽、蛻皮激素等活性成分，還含有豐富膳食纖維、維生素、必需氨基酸、礦物質(zhì)（K、P、Mg、Ca、Zn、Fe）等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。藜麥具有降血糖、降血脂、抑制肥胖等保健作用，特別適于“三高”、肥胖和孕嬰人群長期食用。

酵素是酶的舊稱，起源于日本，在中文詞典中稱為“植物之酶的提取物”或“植物酶提取之精華”[3]，是一類具有催化作用的特殊的復(fù)雜蛋白質(zhì)。食用酵素是一種或多種新鮮蔬菜、瓜果、藥食同源藥材、可食用有益菌等原料通過發(fā)酵過程而產(chǎn)生功能性發(fā)酵產(chǎn)品，且其中含有豐富的酶、礦物質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物、維生素等多種營養(yǎng)成分。研究表明，微生物酵素富含多酚、有機(jī)酸、氨基酸、維生素、多糖、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[4]。此外，有研究表明發(fā)酵原料經(jīng)微生物發(fā)酵成酵素后，發(fā)酵酶液中含有多種功效酶，主要包括超氧化物歧化酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等，從理論上證明酵素具有減肥功效[5]。

隨著人們保健意識不斷增強(qiáng)，以及對綠色食品需求的增加，藜麥相關(guān)產(chǎn)品的市場越來越廣闊。因此，以藜麥為原料，將其與活性酵母液共同發(fā)酵制成藜麥酵素，以脂肪酶活力及DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，采用單因素結(jié)合正交試驗(yàn)進(jìn)行篩選，以期獲得藜麥酵素的最佳制備工藝，為藜麥相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

藜麥（山東老鄉(xiāng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司）；玉米油（山東三星玉米產(chǎn)業(yè)科技有限公司）；高活性干酵母（安琪酵母股份有限公司）；聚乙烯醇（1788型，克拉瑪爾試劑公司）；磷酸二氫鉀（成都化學(xué)試劑廠）；氫氧化鈉（成都市科龍化工試劑廠）；酚酞、鄰苯二酸氫鉀（天津市北辰方正試劑廠）；甲醇、無水乙醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；維生素C（S1300-25 g，上海源葉生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，B25609-20 mg，上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鄭州匯成科工貿(mào)有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S，江蘇正基儀器有限公司）；電子天平（JD2000-2，沈陽龍騰電子有限公司）；手提式壓力蒸汽滅菌器（XFS-208CB，浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；優(yōu)普系列超純水器（UPT-Ⅱ-10T，成都超純科技有限公司）；電子調(diào)溫萬用爐（DK-98-Ⅱ，天津天泰儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-500，北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-400，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；可見分光光度計(jì)（722型，上海萊帕德科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)方法

1.2.1.1 加水量考察方法

稱取50 g藜麥5份，精密稱定，分別置于5個(gè)500 mL燒杯中，按加水量2，3，4，5和6倍，分別往其中加入100.00，150.00，200.00，250.00和300.00 mL純化水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，取出后冷卻至40℃以下，分別與3.00 mL活化酵母液混勻，蓋上保鮮膜，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h，4層紗布過濾，所得濾液即為藜麥酵素原液，用堿滴定法測定其脂肪酶活力。

1.2.1.2 發(fā)酵時(shí)間考察方法

稱取50 g藜麥5份，精密稱定，分別置于5個(gè)500 mL燒杯中，按藜麥與水1∶4（g/mL）的比例，分別往其中加入200.00 mL純化水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，取出后冷卻至40 ℃以下，分別與3.00 mL活化酵母液混勻，蓋上保鮮膜，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12，24，36，48和60 h，4層紗布過濾，所得濾液即為藜麥酵素原液，用堿滴定法測定其脂肪酶活力。

1.2.1.3 發(fā)酵溫度考察方法

稱取50 g藜麥5份，精密稱定，分別置于5個(gè)500 mL燒杯中，按藜麥與水1∶4（g/mL）的比例，分別往其中加入200.00 mL純化水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，取出后冷卻至40 ℃以下，分別與3.00 mL活化酵母液混勻，蓋上保鮮膜，分別放入28，31，34，37和40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，4層紗布過濾，得藜麥酵素原液，用堿滴定法測定其脂肪酶活力。

1.2.1.4 接種量考察方法

稱取50 g藜麥5份，精密稱定，分別置于5個(gè)500 mL燒杯中，按藜麥與水1∶4（g/mL）的比例，分別往其中加入200.00 mL純化水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，取出后冷卻至40 ℃以下，分別與5.00，10.00，15.00，20.00和25.00 mL活化酵母液混勻接種（即接種量分別為10%，20%，30%，40%和50%），蓋上保鮮膜，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12 h，4層紗布過濾，所得濾液即為藜麥酵素原液，用堿滴定法測定其脂肪酶活力。

1.2.2 正交試驗(yàn)方法

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)，并參考相關(guān)文獻(xiàn)，選擇對發(fā)酵過程影響最重要的3個(gè)因素，即接種量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選最佳發(fā)酵條件（見表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.3 脂肪酶活力測定方法

脂肪酶活力測定參考文獻(xiàn)[6]。計(jì)算藜麥酵素的脂肪酶活力。

式中：X為樣品的酶活力，U/mL；V2為滴定樣品B或C時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V1為滴定空白瓶A時(shí)消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；n為酵素原液的稀釋倍數(shù)；c為制備的氫氧化鈉滴定液的濃度，mol/L；0.05為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；50為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液1.00 mL相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；1/15為反應(yīng)時(shí)15 min，以1 min計(jì)。

1.2.4 DPPH自由基清除率測定方法

DPPH自由基清除率測定根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]。計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白組中DPPH溶液和甲醇混合液的吸光度；Aj為試驗(yàn)組（陽性對照組）中藜麥酵素工作液（維生素C溶液）和DPPH混合液的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，加水量在2～4倍之間時(shí)，藜麥酵素脂肪酶活力隨加水量增多而上升；加水量為4倍時(shí)，其脂肪酶活力達(dá)到最大值，為63.36 U/mL；但隨著加水量繼續(xù)上升，脂肪酶活力開始下降。藜麥酵素脂肪酶活力隨著加水量上升呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，可能是由于水分較少時(shí)，混合物發(fā)酵不完全，產(chǎn)生的脂肪酶較少，而當(dāng)水分過多時(shí)，生成的脂肪酶被稀釋，濃度較低。因此，最適宜加水量為4倍。

圖1 加水量對藜麥酵素脂肪酶活性的影響

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的考察結(jié)果

由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間少于36 h，藜麥酵素脂肪酶活力隨時(shí)間延長而上升，發(fā)酵時(shí)間36 h時(shí)，其脂肪酶活力達(dá)到最大值，為74.36 U/mL，但36 h后繼續(xù)發(fā)酵，脂肪酶活力隨時(shí)間的延長反而呈下降趨勢。藜麥酵素脂肪酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間增長呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，可能與發(fā)酵過程中酵母菌產(chǎn)生脂肪酶較多，但藜麥中脂肪含量下降有關(guān)。因此，最適宜發(fā)酵時(shí)間為36 h。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對脂肪酶活力的影響

2.1.2 發(fā)酵溫度考察結(jié)果

由圖3可知，發(fā)酵溫度達(dá)37 ℃前，藜麥酵素脂肪酶活力隨溫度升高而上升，發(fā)酵溫度37 ℃時(shí)，其脂肪酶活力達(dá)到最大值，為52.80 U/mL，但隨著溫度繼續(xù)升高，脂肪酶活力反而呈下降趨勢。藜麥酵素的脂肪酶活力隨著發(fā)酵溫度升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，分析其原因可能是溫度較低時(shí)，酵母菌生長受到抑制，溫度過高則引起部分酵母菌失活，因此，最適宜發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對脂肪酶活力的影響

2.1.3 接種量的考察結(jié)果

由圖4可知，接種量10%～30%時(shí)，藜麥酵素脂肪酶活力隨接種量增多而上升，接種量30%時(shí)，其脂肪酶活力達(dá)到最大值，為69.52 U/mL，但隨著接種量增加到40%～50%時(shí)，脂肪酶活力反而開始下降。藜麥酵素脂肪酶活力隨著接種量增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，說明較低濃度酵母菌在一定時(shí)間內(nèi)可使發(fā)酵液中脂肪酶活性明顯增強(qiáng)，但濃度過高會(huì)減少脂肪酶生成，因此，最適宜接種量為30%。

圖4 接種量對脂肪酶活力的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

選擇脂肪酶活力和DPPH自由基清除率2項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)評分，綜合評分=脂肪酶活力×0.6+DPPH自由基清除率×0.4。正交試驗(yàn)結(jié)果及綜合評分見表2。

方差分析見表3。由正交試驗(yàn)綜合評分及方差分析結(jié)果可知，3個(gè)因素的影響程度各不相同，比較所得p值可知，發(fā)酵時(shí)間對制備藜麥酵素的綜合影響具有顯著性（p＜0.05），發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對綜合評分的影響均無顯著性差異。由此可知，發(fā)酵時(shí)間應(yīng)選最佳水平，發(fā)酵溫度和接種量根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。確定藜麥酵素最佳發(fā)酵條件組合為A3B2C1，即：發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量20%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照2.2所得的最佳工藝制備藜麥酵素，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測定其脂肪酶活力和DPPH自由基清除能力，并計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

結(jié)果表明，3次驗(yàn)證試驗(yàn)的綜合評分平均為72.12分，RSD值為2.36%，證明藜麥酵素的最佳制備工藝穩(wěn)定可行，按照該工藝發(fā)酵制得的藜麥酵素有較好的脂肪酶活性和DPPH自由基清除能力。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 還原能力對比試驗(yàn)結(jié)果

以維生素C為陽性對照，按照1.2.4的方法操作，分別測定最佳工藝制備的藜麥酵素與維生素C的DPPH自由基清除率，比較二者還原能力。結(jié)果如圖5和圖6所示。

結(jié)果表明，藜麥酵素清除DPPH自由基的擬合線性方程為y=0.066 8x-0.946，R=0.999 0，DPPH自由基清除率與藜麥酵素工作液的量呈良好線性關(guān)系；維生素C工作液清除DPPH自由基的擬合線性方程為y=0.244 9x-3.456，R=0.996 7，DPPH自由基清除率與維生素C工作液的量呈良好的線性關(guān)系。經(jīng)計(jì)算可知，清除率50%時(shí)，21.65 μL藜麥酵素液與16.15 μL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的維生素C溶液的抗氧化能力相當(dāng)，即藜麥酵素液還原力相當(dāng)于維生素C溶液的75%。表明藜麥酵素具有良好抗氧化能力。

圖6 維生素C清除DPPH自由基結(jié)果

3 結(jié)論與討論

糧谷類酵素經(jīng)發(fā)酵制成酵素后，不僅保留原材料自身含有的營養(yǎng)物質(zhì)，還增加其中有些功能性成分含量，產(chǎn)生新的生物活性成分，增強(qiáng)其可食用性和保健功能。試驗(yàn)以藜麥為主要原料，以脂肪酶活力和DPPH自由基清除率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)粗選藜麥酵素的發(fā)酵條件，并采用正交試驗(yàn)對其進(jìn)行優(yōu)化。

通過單因素結(jié)合正交試驗(yàn)，篩選出藜麥酵素最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度37 ℃、接種量20%。按此工藝制備而成的藜麥酵素的脂肪酶活力可達(dá)67.76 U/mL，DPPH自由基清除率可達(dá)79.62%。還原能力對比試驗(yàn)表明，清除率50%時(shí)，藜麥酵素液還原力相當(dāng)于質(zhì)量濃度為1 mg/mL維生素C溶液的75%。證明按照試驗(yàn)所得最佳工藝制備的藜麥酵素具有良好脂肪酶活性和抗氧化能力。

在我國，由藜麥發(fā)酵制備的產(chǎn)品尚為數(shù)不多，相關(guān)技術(shù)研究有待深入。試驗(yàn)結(jié)果為藜麥發(fā)酵產(chǎn)品的相關(guān)研究提供更多參考依據(jù)，豐富藜麥產(chǎn)品市場，推動(dòng)藜麥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。