響應(yīng)面法優(yōu)化提取苦豆子生物堿及其抑菌性

王福玲

1. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院（藥物工程技術(shù)研究中心）（哈爾濱 150076）；2. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，細(xì)胞與分子生物學(xué)研究所（哈爾濱 150076）

苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）系豆科槐屬多年生草本植物，別名草本槐、苦豆草、苦甘草、苦豆根等。全株性寒，味極苦。主要分布于我國西北地區(qū)[1]，是一種分布量大的野生荒漠植物，不僅具有耐鹽堿、耐干旱等環(huán)境保護性質(zhì)，還具有清熱解毒、祛風(fēng)燥濕、止痛殺蟲等藥理活性。全草、根、莖及種子都可入藥[2]。含有苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、槐果堿等20多種生物堿，其中含量較高的為喹諾里西啶結(jié)構(gòu)的槐果堿。苦豆子生物堿不僅具有抗癌和殺滅各種微生物的藥理活性，而且對神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)有廣泛的藥理作用[3]。

1 材料與儀器

苦豆子購于澤林大藥房，產(chǎn)地為內(nèi)蒙，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連教鑒定為豆科槐屬植物苦豆子（Sophora alopecuroidesL.）的成熟種子，經(jīng)粉碎過40目篩備用。槐果堿標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC≥98%，批號151127，四川省維克奇生物科技有限公司）；溴麝香草酚藍(lán)（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑）；無水乙醇、氯仿等試劑均為國產(chǎn)分析純。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌由哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院保存。

KQ32000V數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；高速萬能粉碎機（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；LD4-2A低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；BSA224S精密電子天平（Sartorius）；DB-20R紫外可見分光光度計（Dynamica）。

2 方法

2.1 苦豆子生物堿提取工藝流程

苦豆子粉→加入提取溶劑（乙醇）→超聲波提取→離心（3 000 r/min，10 min）→上清液（粗提液）

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[4]

稱取10 mg槐果堿標(biāo)準(zhǔn)品，置10 mL容量瓶，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻得槐果堿標(biāo)準(zhǔn)液。取0，10，20，30，40和50 μL上述溶液，分別置于50 mL的磨口錐形瓶中，乙醇揮發(fā)后，加6 mL溴麝香草酚藍(lán)pH 7.6緩沖液、6 mL氯仿，加塞劇烈振搖2 min，靜置2 h后分出氯仿層，同法處理無槐果堿液為空白，在420 nm處測定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，氯仿層標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制回歸方程。

2.3 苦豆子生物堿得率測定

超聲提取后將提取液過濾，提取液用無水乙醇稀釋50倍，定容于50 mL容量瓶中，吸取1 mL稀釋液至錐形瓶中，按2.2項下方法操作，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出提取液中生物堿的濃度，計算得率[5]。

2.4 單因素試驗

稱取苦豆子粉各2.000 g，以乙醇溶液為溶劑，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（55%，65%，75%，85%和95%）、料液比（1∶8，1∶12，1∶16，1∶20，1∶24 g/mL）、超聲提取時間（10，20，30，40和50 min）等因素對苦豆子生物堿得率的影響。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化苦豆子生物堿提取工藝

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行Box-Behnken中心組合試驗，以苦豆子總堿得率為響應(yīng)值，通過響應(yīng)面分析，來確定提取苦豆子生物堿的最佳提取條件。

2.6 苦豆子生物堿的抑菌性測定

2.6.1 濾紙片法測定生物堿的抑菌圈

無菌環(huán)境下，將活化好的菌種濃度稀釋到105CFU/mL。將生物堿浸膏配制成20 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液，以無菌水為對照[6]。分別用移液槍吸取150 μL菌懸液，涂布在標(biāo)記好的固體平板培養(yǎng)基上，再取浸有生物堿的無菌濾紙片貼在含菌平板上，重復(fù)操作3次。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量各個抑菌圈直徑，計算平均值。

2.6.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

將20 mg/mL苦豆子生物堿溶液加入到96孔板第一行中，用倍比稀釋法使其每一列質(zhì)量濃度為20，10，5，2.5，1.25，0.625，0.312 5和0.156 25 mg/mL。以不含生物堿的菌液孔作對照，96孔板的其余列分為3個部分，分別加入100 μL的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌菌液。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察溶液的澄清度，確定苦豆子生物堿對3種菌的最低抑菌濃度[7]。

3 結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

圖1為槐果堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程y=0.099 5x+0.013 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 5。在0～8.33 μg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 槐果堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 單因素試驗

3.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦豆子生物堿得率的影響

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，苦豆子生物堿得率先上升后下降。可能是乙醇體積分?jǐn)?shù)過大，不利于水溶性生物堿的溶出，提取液極性過低會導(dǎo)致總生物堿得率下降。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對生物堿得率的影響

3.2.2 料液比對苦豆子生物堿得率的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，苦豆子生物堿得率逐漸增大，然后稍有下降。說明苦豆子生物堿在料液比為1∶16（g/mL）左右時得率達(dá)到最大，再增加提取液的體積造成溶劑的浪費。

3.2.3 超聲時間對苦豆子生物堿得率的影響

由圖4可知，隨著提取時間的增加，苦豆子生物堿得率緩慢增加，然后略有下降。說明在30 min時苦豆子生物堿已經(jīng)基本提取完全，延長時間可能會導(dǎo)致生物堿分解，使得率下降。

3.3 優(yōu)化試驗及響應(yīng)面分析

以-1，0，1分別代表自變量的低、中、高水平，因子編碼及水平見表1，不同條件下苦豆子生物堿的得率見表2。

圖3 料液比對生物堿得率的影響

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼表

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.0.7.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，可以得到苦豆子生物堿得率（Y）對各個因素變量的二次方程為：Y=2.94+0.096X1+0.11X2+，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知：模型的p＜0.000 1，說明試驗所選用的模型具有顯著性。失擬項F=3.91，失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2Adj=0.997 2，說明該模型能解釋99.72%的響應(yīng)值變化，模型確定系數(shù)R2=0.998 8，R2Pred=0.985 1，說明此模型擬合度較為良好[8]，可以對不同條件下苦豆子生物堿得率進行預(yù)測。由F值可知，顯著性次序為料液比（X2）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（X1）＞超聲時間（X3）。

表3 回歸方程方差分析表

圖5 Z=f（X1，X2）的響應(yīng)面與等值線

圖6 Z=f（X1，X3）的響應(yīng)面與等值線

圖7 Z=f（X2，X3）的響應(yīng)面與等值線

應(yīng)用Design Expert 8.0.7.1軟件繪出響應(yīng)面圖及等高線進行分析。圖5～圖7顯示3組試驗參數(shù)以苦豆子生物堿得率為響應(yīng)值的趨勢圖，等高線可以更加直觀地反映出兩個變量的情況。乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間的交互作用，以及料液比和超聲時間的交互作用對苦豆子生物堿的得率影響顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間的交互作用不顯著。

根據(jù)響應(yīng)曲面模型求出最優(yōu)組合，并綜合響應(yīng)曲面圖分析，得到苦豆子總堿的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)66.79%、料液比1∶16.88（g/mL）、超聲時間30.41 min。

3.4 驗證試驗

考慮到實際操作的方便，將提取工藝參數(shù)修正為：乙醇體積分?jǐn)?shù)67%、料液比1∶17（g/mL）、超聲時間30 min。試驗重復(fù)3次。在此條件下，實際測得的得率為2.96%，與理論預(yù)測值2.97%基本一致。說明能夠真實反映篩選因素對苦豆子生物堿得率的影響。

3.5 苦豆子生物堿的抑菌性結(jié)果

由表4可知，苦豆子生物堿對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑制作用較強。

表4 苦豆子生物堿抑菌試驗結(jié)果（n=3，x±s）

4 討論與結(jié)論

我國苦豆子資源極其豐富，具有藥用及生態(tài)雙重價值。為了深入研究，應(yīng)當(dāng)采用適當(dāng)?shù)娜軇┖头椒ǎ瑢⒅兴幉闹心繕?biāo)成分盡可能多地從植物組織中溶出轉(zhuǎn)移。超聲波在液體中高頻振動產(chǎn)生的“空化效應(yīng)”，可以破壞細(xì)胞組織，有助于有效成分的溶出，操作簡單，提取時間短，得率高，降低了過程能耗，有著其他傳統(tǒng)提取方法不可比擬的優(yōu)勢。響應(yīng)面法（RSM）通過數(shù)學(xué)模型解決受多種因素影響的各因素及它們之間的交互作用對響應(yīng)值產(chǎn)生的影響，常用于優(yōu)化有效成分的提取工藝組合[9]，優(yōu)于只能分析離散條件的正交試驗設(shè)計。由于苦豆子中含有喹諾里西啶類生物堿，有一定的水溶性，用氯仿難以提取完全，使測定結(jié)果偏低。因此，試驗采用溴麝香草酚藍(lán)為酸性染料的紫外分光光度法測定生物堿得率。可以較好地保證測定結(jié)果的重現(xiàn)、穩(wěn)定和準(zhǔn)確可靠，此外溴麝香草酚藍(lán)緩沖液最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

試驗采用超聲輔助有機溶劑法提取苦豆子中總生物堿，根據(jù)酸性染料紫外分光光度法測定的得率，通過響應(yīng)面法中的Box-Behnken模式優(yōu)化確定超聲輔助提取的最佳工藝參數(shù)，并測定其體外抑菌活性，為苦豆子的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)，也為苦豆子生物堿的抗腫瘤、抗菌等藥理活性的研究提供理論基礎(chǔ)。