乳酸菌粉培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配研究及應(yīng)用

李鵬沖，張立攀*，章建軍，趙夢瑤，劉兵戈，董建民

河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司（鄭州 450002）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱[1]。乳酸菌是具有多重生理功能的微生物菌群，能夠促進人體內(nèi)乳酸酶的產(chǎn)生，使乳糖不耐癥患者的發(fā)病率得到明顯的降低[2]。乳酸菌發(fā)酵后產(chǎn)物賦予食品不同風味，另難以被人體消化吸收的大分子營養(yǎng)物質(zhì)被分解，微量元素含量得到增加，提高了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值和人體的吸收利用率[1]。乳酸菌能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的生物菌群，改善腸道功能且發(fā)酵后過氧化氫等抗性物質(zhì)夠抑制微生物的生長繁殖，可延緩產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[3]。乳酸菌因?qū)θ藗兊纳眢w健康有著不可忽視作用，使其受到社會各界廣泛關(guān)注的目光，在食品行業(yè)中，中國的發(fā)酵乳制品占益生菌制品總量的1/2以上，并且每年的增長速度相當可觀[4]。2015年果蔬發(fā)酵提出，便受關(guān)注，其主要是將多種乳酸菌種按照比例接到果蔬汁中。共同作用使果蔬汁發(fā)生復(fù)雜的生物學反應(yīng)，飲料各項品質(zhì)得到提高。目前，國內(nèi)外已經(jīng)研究出將有益微生物制成含有活菌菌體和代謝產(chǎn)物的益生菌制劑[5]。益生菌的應(yīng)用更加趨向于多樣化，必將成為未來發(fā)展的流行趨勢。

傳統(tǒng)的乳酸菌發(fā)酵劑制法不僅過程復(fù)雜繁瑣，而且效果并不理想[6]。為此，企業(yè)迫切需要一種操作簡單、含菌量高、直投式發(fā)酵劑。目前我國乳酸菌發(fā)酵劑操作系統(tǒng)不夠完善，很多大中型企業(yè)生產(chǎn)所需要的發(fā)酵劑都通過國外獲得。直投式乳酸菌粉具有活力高、適應(yīng)能力強等優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵劑的特點，能夠打破傳統(tǒng)企業(yè)生產(chǎn)的局限，生產(chǎn)量得到大幅度提高[7]。因此研發(fā)一種適合我國企業(yè)生產(chǎn)的直投式發(fā)酵劑成為當前首要任務(wù)。

為了培育符合要求的乳酸菌粉，試驗通過對培育乳酸菌的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)素成分的比例進行調(diào)整以達到目的。目前很多知名專家都對乳酸菌發(fā)酵劑增菌培養(yǎng)基方面展開了研究，并且取得了相當不錯的成績。例如房興利等[8]通過對MRS培養(yǎng)基、葡萄糖酵母培養(yǎng)基進行改良；劉宇峰等[9]用含有胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、葡萄糖、NaCl、L-半胱氨酸的復(fù)合培養(yǎng)和天然脫脂乳培養(yǎng)基分別培養(yǎng)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌得出脫脂乳優(yōu)于復(fù)合培養(yǎng)基；姜曄[10]以胡蘿卜汁作為生長促進劑。對于乳酸菌劑的保存，常壓干燥法具有效果理想、成本較低的優(yōu)勢，很適合企業(yè)生產(chǎn)使用。研究的目標對乳酸菌粉載體和培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化，通過常壓干燥的方法獲得乳酸菌菌粉，為發(fā)酵果蔬提供科學依據(jù)。

1 試驗材料與儀器

1.1 材料

菌種：植物乳酸菌、嗜酸乳酸菌為河南省商業(yè)科學研究所有限責任公司實驗室保存菌種。

培養(yǎng)基：（1）種子液培養(yǎng)基為MRS肉汁種子培養(yǎng)基。載體培養(yǎng)基（簡稱DD培養(yǎng)基）山楂：山東沂蒙山楂優(yōu)果。

1.2 主要試劑

MRS牛肉膏粉末為生化級試劑，葡萄糖均為分析純試劑，β-環(huán)糊精、麥芽糊精、抗性糊精、大豆蛋白、菊粉均為食品級添加劑。

果膠酶（食品級，酶活力10 000 U/g）上海生物科技有限公司；無水乙醇（C2H6O）；硫酸（H2SO4優(yōu)級純）；氫氧化鈉（40 g/L）等均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

JY2002電子天平，上海橫平儀器表廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LH-250R生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；N2S可見分光光度測定儀，上海儀電分析儀器有限公司；離心機L550，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；電磁爐JYC-21，九陽股份有限公司；生化培養(yǎng)箱LRH-250，上海一恒科學儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 制備乳酸菌劑試驗過程

將活化后的試管斜面保存菌種嗜酸乳酸菌和植物乳酸菌分別接種于含MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)24 h左右，然后接種于DD培養(yǎng)基中，混合均勻，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱24 h培養(yǎng)。

2.2 單因素試驗

2.2.1 碳源的添加量對菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中蛋白粉和水分的量，對葡萄糖進行調(diào)控。分別向DD培養(yǎng)基中添加2%，3%，4%，5%，6%和7%的葡萄糖。待所有成分都加完后混合攪拌均勻，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。測其吸光度，確定最佳碳源量范圍。

2.2.2 氮源的添加量對菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中葡萄糖和水的量，對蛋白粉進行調(diào)控。分別向載體中添加0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的蛋白粉，待所有成分都加完后混合攪拌均勻，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。確定最佳氮源量范圍。

2.2.3 水分的添加量對菌株的影響

固定DD培養(yǎng)基中葡萄糖和蛋白粉的量，對加水量進行調(diào)控。分別向載體中添加5.0%，7.5%，10.0%，12.5%，15.0%和17.5%的水量，待所有成分都加完后混合攪拌均勻，放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。確定最佳加水量范圍。

2.3 正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，以乳酸菌的吸光度為考察指標，采用正交試驗對葡萄糖（A）、蛋白粉（B）和水分添加量（C）3個因素進行考察，其中每個因素均有3個水平，見表1。

表1 DD培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配正交試驗設(shè)計因素水平表

2.4 檢測方法

接入菌種的載體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，進行菌密度測定。菌量測定采用比濁法：1 g樣品采用梯度稀釋法稀釋到100倍，從稀釋100倍的樣液中取一部分倒入比色皿中，以生理鹽水作為參照，在600 nm波長處用可見分光光度儀對吸光度（A）進行測定。吸光度與菌落總數(shù)成正比。記錄數(shù)據(jù)。

2.5 乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料的制備

2.5.1 工藝流程

山楂果挑揀→去核（稱量）→清洗→加水煮制（100 ℃，10 min）→打漿→冷卻→酶解（單寧酶、果膠酶）→滅酶→滅菌→發(fā)酵（乳酸菌劑）→成品

2.5.2 基礎(chǔ)工藝條件

1) 參考張志軍[11]的方法，用果膠酶對山楂汁進行處其工藝理略作調(diào)整：即酶解溫度48 ℃，酶添加量為0.9%，酶解時間為4 h測相應(yīng)指標。出汁率測定：參考任曼妮[12]的方法。含酸量測定：參考國標GB 5009.157—2016。還原糖測定：參考國標GB/T 15038—2006。

式中：W1為測得的單寧含量；C為由工作曲線查出的鞣酸質(zhì)量濃度，μg/mL；m為稱取的樣品質(zhì)量，g；V為樣品溶液的體積，mL。

3) 參考李剛等[17]發(fā)酵山楂汁工藝略作修改：取酶處理并滅酶滅菌的山楂汁，接種量4%、發(fā)酵溫度37℃、發(fā)酵時間18 h、混合糖添加質(zhì)量分數(shù)為8%（蔗糖與葡萄糖質(zhì)量比3∶2），進行培養(yǎng)發(fā)酵。

2.6 感官評價

對發(fā)酵山楂飲料的指標進行測定并進行感官評定。

3 結(jié)果與分析

3.1 乳酸菌粉工藝優(yōu)化分析

3.1.1 葡萄糖添加量對乳酸菌吸光度的影響

圖1顯示，隨著葡萄糖的添加量的逐步增加，乳酸菌粉的吸光度呈上升趨勢。當葡萄糖的添加量為6%時，菌粉的吸光度增長速度最快，當葡萄糖添加量繼續(xù)上升時，菌粉的吸光度增長速度減緩，故試驗中選擇葡萄糖的添加量為6%左右。

圖1 不同比例的葡萄糖添加量對乳酸菌吸光度的影響

3.1.2 蛋白粉添加量對乳酸菌吸光度的影響

圖2顯示，當?shù)鞍追鄣暮恐鸩皆黾訒r，菌粉的吸光度整體呈上升趨勢。當葡萄糖的添加量為2.5%時，菌粉的吸光度增長速度最快，當?shù)鞍追厶砑恿坷^續(xù)上升時，菌粉的吸光度增長速度減緩，故試驗中選擇蛋白粉的添加量為2.5%左右適宜。

(1)激光雷達技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展，主要指激光雷達系統(tǒng)中的硬件部分。創(chuàng)新和發(fā)展激光光源技術(shù)、發(fā)射和接收技術(shù)、信號采集和處理技術(shù)是提高大氣環(huán)境監(jiān)測精度的最直接方法。

3.1.3 加水量對乳酸菌吸光度的影響

圖3顯示了不同比例的水分含量對乳酸菌吸光度的影響結(jié)果。當水分含量逐步增加時，菌粉的吸光度在剛開始呈上升趨勢，隨著水分含量增加，乳酸菌吸光度反而下降。當葡萄糖的添加量為15.5%時，菌粉的吸光度增長速度最快，故試驗中選擇加水量為15.5%左右。

圖2 添加不同比例的蛋白粉對乳酸菌吸光度的影響

圖3 添加不同比例的水分對乳酸菌吸光度的影響

3.1.4 葡萄糖、蛋白粉及加水量對乳酸菌吸光度的影響

為了進一步了解葡萄糖、蛋白粉及加水量對乳酸菌吸光度的綜合影響，試驗對其進行了正交優(yōu)化（表2），根據(jù)正交試驗設(shè)計共得出9組試驗結(jié)果（表3），其試驗結(jié)果數(shù)據(jù)均為3次試驗得到的平均值。結(jié)果見表3。

試驗所制乳酸菌粉呈細小固體顆粒狀，質(zhì)感較為蓬松干燥，顏色呈米黃色，具有乳酸菌發(fā)酵氣味。根據(jù)正交設(shè)計試驗，由表2可得出，葡萄糖添加量（A）、蛋白粉添加量（B）和水分添加量（C）對菌粉中乳酸菌數(shù)量的影響順序為：C＞A＞B。最佳組合為A3B1C3。在24 h培養(yǎng)前對乳酸菌粉進行檢測，得出菌粉吸光度3次平均值為0.012，24 h培養(yǎng)后最佳菌粉組合吸光度3次平均值為0.049，增長量達到75%以上。即葡萄糖添加量為6%，蛋白粉添加量為2.5%，加水量為15.5%時，此時的菌粉中的乳酸菌含量最高，增長率高達408.3%，增菌效果顯著。

3.2 乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料的分析

3.2.1 山楂汁酶處理的分析

3.2.1.1 果膠酶處理分析

通過表4可以看出，山楂汁在此工藝下出汁率達到54.0%，含酸量達到1.63%，還原糖含量達到4.13%。

3.2.1.2 單寧酶處理分析

據(jù)式（1）計算出單寧含量的0.31%，山楂單寧含量的降低可以改善其對山楂飲料品質(zhì)與口感的影響[18]。

表2 正交試驗因素水平表

表3 DD培養(yǎng)基優(yōu)化復(fù)配正交試驗設(shè)計結(jié)果

表4 酶處理后指標檢測

3.2.2 感官評價分析

參考葡萄酒的評價標準對乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料進行評價如表5所示。

通過表5可看出，經(jīng)過六人小組評價得分在66～72分之間變動，具有乳酸發(fā)酵的獨特風味，說明此山楂發(fā)酵飲料結(jié)果的可行性[19]。相比傳統(tǒng)的發(fā)酵，縮短工藝，產(chǎn)生效益。

表5 山楂飲料感官評價

4 結(jié)論

1) 試驗通對果蔬發(fā)酵乳酸菌粉培養(yǎng)基進行優(yōu)化復(fù)配研究，得出結(jié)論，葡萄糖的添加量為6%，蛋白粉的添加量為2.5%，水的添加量為15.5%時，此時菌粉中的乳酸菌含量最高，增長量達到75%以上，增菌效果顯著。

2) 通過對山楂汁進行酶處理，使得山楂汁中的出汁率了達到54.0%，含酸量為1.63%，還原糖含量為4.13%。并使得單寧的含量降低到了0.31%，改善了發(fā)酵山楂飲料的口味與品質(zhì)。

3) 利用乳酸菌劑發(fā)酵山楂飲料口味獨特，相比傳統(tǒng)發(fā)酵極大縮短時間。

通過發(fā)酵菌劑發(fā)酵提高了企業(yè)的生產(chǎn)效率，使企業(yè)產(chǎn)量得到增加。后期可以再對乳酸菌粉進行干燥處理，制得水分含量低的菌粉，在方便保藏的同時，有效地防止了菌種的污染和老化，打破了企業(yè)生產(chǎn)的局限性，適合企業(yè)的生產(chǎn)使用。