響應面法優化虎杖大黃素的提取工藝

董加寶 ，彭心潔，賀思

1. 湖南科技學院湘南優勢植物資源綜合利用重點實驗室（永州 425199）；2. 湖南科技學院化學與生物工程學院（永州 425199）

虎杖為蓼科蓼屬多年生草本植物的根莖，是我國一種傳統中藥，大量分布于西北、華東、華中、華南及西南等地，具有悠久的藥用歷史。虎杖中除白藜蘆醇外最重要的活性成分是虎杖大黃素，大黃素可通過抑制血小板衍生生長因子、轉化生長因子來阻斷肝星狀細胞的活化，從而發揮抗纖維化作用[1-2]。大黃素還對肝纖維化肺損傷具有一定的保護作用[3]，增加巨噬細胞識別和吞噬能力，減輕炎癥反應[4]、保護心肌細胞、減輕心肌炎癥[5-6]。研究表明，大黃素對非酒精性脂肪肝有治療作用[7-9]，可預防膽固醇結石的形成[10]、抑制金黃色葡萄球菌[11-12]、抗腫瘤[13]，在食品工業上可以起到抗氧化、抑制食品糖基化產物形成的作用[14]。

目前，從虎杖花及果實中提取大黃素主要方法有雙水相萃取[15]、正交試驗提取[16]、超聲輔助提取[17-18]。試驗以虎杖根為原料，采用響應面法優化虎杖中大黃素的提取工藝條件，以期為優化虎杖大黃素的提取提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大黃素標準品（成都克洛瑪生物科技有限公司）；虎杖根（采自永州市零陵區西山，放置于80 ℃烘箱中烘干，經粉碎后過100 目篩得虎杖粗粉，避光保存備用）；甲醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；三氯甲烷、乙酸乙酯、無水乙醇、乙醚（均為分析純，天津市大茂化學試劑廠）。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀（日本島津有限公司）；JA1003N電子天平（上海菁海儀器有限公司）；FW177粉碎機（湖南東晟電子有限公司）；DZF-6050真空干燥箱、SHB數顯三用恒溫水箱（鞏義市英谷高科儀器廠）。

1.3 虎杖根大黃素提取單因素試驗

不同溶劑對大黃素的提取效果：稱取5份0.5 g的虎杖粗粉，倒入試管中，在30 ℃下分別取用10 mL的95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水、乙醚振蕩浸提30 min，取浸提液過濾，測定提取率。

不同溶劑濃度對大黃素的提取效果：配置體積分數為65%，70%，75%，80%和85%的乙醇溶劑，分別振蕩浸提30 min后，取浸提液過濾，測定提取率。

不同溫度對大黃素的提取效果：分別在20，30，40，50和60 ℃的溫度下，加入75%乙醇，振蕩浸提30 min后，取浸提液過濾，測定提取率。

不同時間對大黃素的提取效果：振蕩提取時間分別為10，20，30，40和50 min，取浸提液過濾后測定提取率。

不同料液比對大黃素的提取效果：取相同量虎杖粉在40 ℃下，按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）加入75%乙醇溶劑，浸提30 min，取浸提液過濾，測定提取率。

1.4 響應面試驗設計優化提取條件

以乙醇體積分數（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為自變量，以虎杖大黃素提取率為響應值，用Design-Expert 8.0.6軟件進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.5 大黃素的測定方法

取1 mL提取液，轉移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾膜濾過、脫氣后按壽林均等[19]的方法測定。

2 結果與分析

2.1 不同溶劑種類對虎杖大黃素提取率影響

由圖1可知，在其他條件相同的情況下，用95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水以及乙醚對虎杖大黃素進行提取，其中以95%乙醇的提取率最高，且乙醇無毒、安全性高。因此，選用乙醇作為虎杖根大黃素的最佳溶劑。

2.2 不同溶劑體積分數對虎杖大黃素提取率的影響

從圖2可知，乙醇體積分數為75%時提取率最高，當體積分數繼續升高時，提取率有下降的趨勢。相關研究也表明乙醇體積分數過高會增加其他雜質的溶出量，從而導致大黃素提取率的下降[17]。故選用75%的乙醇進行進一步研究。

2.3 不同提取溫度對虎杖大黃素提取率的影響

從圖3可以得出，隨著提取溫度的升高，虎杖大黃素的提取率先上升后下降，當提取溫度達到40 ℃時，提取率達到最高，隨后開始下降。相關研究也表明溫度升高能加快大黃素溶解到乙醇中，但是當溫度達到一定值時，提取率下降是因為偏高的溫度造成溶劑的揮發和大黃素分子的部分氧化分解[17]。

圖1 不同溶劑種類對虎杖大黃素提取率的影響

圖2 不同溶劑體積分數對大黃素提取率的影響

圖3 不同提取溫度對大黃素提取率的影響

2.4 不同提取時間對虎杖大黃素提取率的影響

從圖4可知，隨著提取時間的延長，虎杖大黃素的提取率先上升后下降，當提取時間為30 min時提取率達到最大值，之后隨著時間的延長，提取率開始有下降的趨勢。劉樹興等[18]采用80%乙醇+丙酮超聲提取大黃素也發現提取時間到達巔峰后會輕微緩慢下降，其原因可能是發生部分氧化。因此，提取時間選取30 min為宜。

2.5 不同料液比對虎杖大黃素提取率的影響

從圖5可以得出，隨溶劑體積增加，大黃素的提取率先上升后趨于穩定，1∶15（g/mL）后上升緩慢，為確保充分提取，實際操作選擇料液比1∶20（g/mL）進行提取。

圖4 不同提取時間對大黃素提取率的影響

圖5 不同料液比對大黃素提取率的影響

2.6 響應面法優化虎杖根大黃素提取工藝

2.6.1 響應面試驗設計與結果

由于料液比在1∶20（g/mL）時提取率基本達到穩定狀態，兼顧提取效率與節省溶劑，選取乙醇體積分數（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）按表1對虎杖中大黃素的提取工藝進行優化，結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果

2.6.2 數據模型建立與回歸分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件三因素三水平Box-Behnken試驗設計對表2數據進行二次多項式逐步回歸擬合，回歸方程為：

Y=0.58+0.002 25A+0.001 125B+0.004 125C+0.002 25AB-0.000 75AC-0.011A2-0.019B2-0.031C2

一次項系數值的大小可以反映因素對響應值的影響程度，由回歸方程可得出提取虎杖根大黃素的主次影響因素順序為：浸提溫度＞乙醇體積分數＞浸提時間。

2.6.3 回歸模型的方差分析

為進一步確定模型可靠性，通過軟件得到的模型方差分析結果和各項系數顯著性檢驗結果見表3。

從表3中可知，模型中p＜0.000 1，說明此次試驗采用的二次模型是十分顯著的。p、p、p2、p2、p2ACABC的值均小于0.05，說明乙醇體積分數、提取溫度與三個因素的二次項均具有顯著影響；而提取時間、交互項及失擬項項顯著性較差。失擬項p=0.066 7＞0.05，表明無失擬因素存在，各因素的效應關系為提取溫度＞乙醇體積分數＞提取時間。

表3 回歸模型各項方差分析

2.6.4 響應面分析

響應曲面的坡度陡峭程度說明影響因素對響應值的影響大小[20]。從3D響應面圖（圖6～圖8）可以看出，各個因素對大黃素提取得率的影響程度。圖8的響應面較為陡峭，說明超聲時間和浸提時間的交互作用較大，但是由表3可知，三個交互作用均未達到顯著性水平。

2.6.5 提取條件的優化及驗證試驗

通過軟件回歸方程對虎杖大黃素進一步優化，由以上結果分析得到最佳提取工藝：乙醇體積分數75.51%、提取時間30.34 min、提取溫度40.65 ℃、料液比1∶20（g/mL）。結合實際條件，最佳工藝選取75.5%乙醇、提取溫度40.6 ℃、提取時間30 min，經3次平行試驗測得平均提取率為0.577%，與預測值0.579%相近，相對誤差為0.35%。采用響應面法優化虎杖中大黃素提取工藝條件是合理可行的。

圖6 乙醇體積分數和提取時間對虎杖大黃素提取交互作用

圖7 乙醇體積分數和提取溫度對虎杖大黃素提取交互作用

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化虎杖根大黃素的提取工藝條件，得出虎杖根大黃素的最佳提取工藝條件：乙醇體積分數75.5%、提取時間30 min、提取溫度40.6 ℃、料液比1∶20（g/mL）。在此條件下大黃素得率可達0.577%。