不同濃度白藜蘆醇對破骨細胞分化的影響及自噬的作用

張倩 韓婕 湯旭磊

蘭州大學第一醫院內分泌科，甘肅 蘭州 730000

破骨細胞是體內唯一具有骨吸收功能的細胞，其形成、分化和功能異常會造成骨吸收異常，骨代謝不平衡，骨吸收超過骨形成會造成骨質疏松等多種骨疾病[1-2]。天然的中草藥提取物白藜蘆醇是一類具有抗炎、抗氧化、抗衰老等多種生物學活性的多酚類化合物，研究顯示白藜蘆醇對缺乏運動[3]、衰老[4]、卵巢切除[5-6]等多種因素引起的骨量丟失都具有骨保護作用。近年來白藜蘆醇對破骨細胞的研究主要集中在炎癥等條件下引起的骨量流失的現象和機制方面。在非炎癥條件下，白藜蘆醇對破骨細胞影響及機制的研究較少。有研究表明自噬參與破骨細胞形成、分化及骨吸收作用等多個階段[7-9]，而白藜蘆醇能夠調節自噬，在不同的細胞中可以誘導自噬，也可以抑制自噬[10-11]。因此本實驗主要研究不同濃度白藜蘆醇對破骨細胞分化的影響及自噬在其中的作用，探討白藜蘆醇影響破骨細胞分化可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞株購自美國ATCC；高糖DMEM培養液(美國HyClone)；胎牛血清、雙抗溶液(四季青)；核因子κВ受體活化因子配體RANKL(美國PeproTech)；TRAP染色試劑盒、白藜蘆醇(美國Sigma)；3-MA(美國Selleck Chemicals)；RT-PCR 試劑盒、DNA Marker(TaKaRa 生物技術公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組：小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞用含10%胎牛血清，1%雙抗溶液的高糖DMEM完全培養基培養于5 %CO2，37 ℃培養箱中。細胞分組Ⅰ：不處理組、RANKL+不同濃度RSV(0、0.1、0.5、1、5及10 μmol/L)組；細胞分組Ⅱ：RANKL+不同濃度RSV(0、0.5、10 μmol/L)組、3-MA+ RANKL+不同濃度RSV(0、0.5、10 μmol/L)組。RANKL誘導濃度為50 ng/mL。3-MA干預濃度和干預時間為10 mmol/L預刺激1 h，在白藜蘆醇干預之前加入。

1.2.2細胞活力檢測：RAW264.7細胞按每孔5×103個細胞的密度接種于96孔培養板，貼壁后按細胞分組Ⅰ處理，分別培養12、24、48、72 h棄上清，加入10 μL的CCK-8溶液，繼續培養2 h在酶標儀上測定各孔在450 nm處的吸光度。

1.2.3TRAP染色：RAW264.7細胞按每孔104個細胞的密度接種于24孔培養板，貼壁后按細胞分組Ⅰ處理，培養第5天固定液固定細胞，去離子水清洗后TRAP染色試劑盒進行染色。經過初染、洗滌、復染、洗滌、晾干等程序后顯微鏡觀察形態并拍照。各組破骨細胞數比值通過Image-Pro Plus軟件對TRAP染色陽性區域進行分析，計算染色區域的百分比。

1.2.4RT-PCR檢測mRNA表達情況：RAW264.7細胞按每孔105個細胞的密度接種于6孔培養板，貼壁后按細胞分組Ⅰ和Ⅱ處理，培養第3天提取RNA，反轉錄后擴增。引物序列如表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primers of target genes

1.2.5Western blot檢測自噬相關蛋白的表達情況：細胞培養及分組同1.2.4，第3天提取蛋白，定量后加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮沸5 min。上樣后進行電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h。放入稀釋好的一抗中Beta Actin(1∶3 000稀釋)，LC3A/B(1∶1 000稀釋)，P62(1∶1 000稀釋)，Becline-1(1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜。TBST清洗3次，放入稀釋好的二抗中(1∶5 000稀釋)，室溫孵育1 h。TBST清洗3次，將ECL發光液均勻加在膜上，曝光并拍照。采用Image J圖像分析軟件，計算各條帶的灰度值，結果以目的蛋白與內參蛋白灰度值之比表示。

1.3統計學處理

實驗結果均以均數±標準差表示，采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。應用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行多組間比較，方差齊性時，組間多重比較應用Fisher Least Significant Difference(LSD)；方差不齊時，應用Dunnett’s T3方法進行組間多重比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1白藜蘆醇對細胞活力的影響

如表1和圖1所示：與不處理組相比，加入50 ng/mL誘導劑RANKL均能促進RAW264.7細胞的增殖(P<0.05)；同時加入0.1～10 μmol/L白藜蘆醇時，細胞增殖活力先上升后下降，在0.5 μmol/L時達到最大。

2.2白藜蘆醇對破骨細胞分化的影響

如圖2所示：RAW264.7細胞在50 ng/mL的RANKL誘導下生成大量TRAP染色陽性破骨細胞。當加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜蘆醇時，TRAP染色陽性破骨細胞數量增多；隨白藜蘆醇濃度增加，破骨細胞數量減少，白藜蘆醇濃度為10 μmol/L時抑制RAW264.7細胞向破骨細胞分化。

表2 白藜蘆醇對細胞活力的影響Table 2 The effect of resveratrol on cell

注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。

圖1 白藜蘆醇對細胞活力影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.1 The effect of resveratrol on cell viability

圖2 不同濃度白藜蘆醇對破骨細胞分化的影響注：與RANKL組相比，*P<0.05。Fig.2 Effects of different concentrations of resveratrol on osteoclast differentiation

2.3不同濃度白藜蘆醇對破骨及自噬相關標志物mRNA表達的影響

如圖3所示：RAW264.7細胞加入RANKL后破骨分化相關標志物CTSK、MMP9、TRAP及自噬相關標記物LC3、P62、Beclin-1的mRNA表達增加。加入不同濃度白藜蘆醇干預，濃度在0.1 μmol/L和0.5 μmol/L時破骨分化相關標志物及自噬相關標記物mRNA表達增加；在1、5、10 μmol/L時隨濃度增加，其mRNA的表達隨之降低。

圖3 不同濃度白藜蘆醇對RANKL誘導下破骨及自噬相關標志物mRNA 表達水平的影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.3 Effects of different concentrations of resveratrol on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers induced by RANKL

圖4 不同濃度白藜蘆醇對自噬相關蛋白表達的影響注：與不處理組比較，*P<0.05，與RANKL組比較，#P<0.05。Fig.4 Effects of resveratrol at different concentrations on the expression of autophagy related proteins

圖5 抑制自噬對破骨及自噬相關標記物mRNA表達的影響注：*P<0.05。Fig.5 Inhibition of autophagy on mRNA expression levels of osteoclast and autophagy related markers

2.4不同濃度白藜蘆醇對自噬相關蛋白表達的影響

如圖4所示：RAW264.7細胞加入RANKL后自噬相關蛋白LC3II/I和Beclin-1的表達增加，P62的表達減少。LC3II/LC3I增加同時P62減少說明自噬活性增強。加入0.1 μmol/L和0.5 μmol/L白藜蘆醇時促進自噬；隨白藜蘆醇濃度升高則抑制自噬活性。

2.5抑制自噬對破骨及自噬相關標記物mRNA表達的影響

加入3-MA，RANKL誘導分化過程中破骨分化相關標志物CTSK、MMP9、TRAP和自噬相關標志物LC3、P62、Beclin-1的mRNA表達減少；0.5 μmol/L白藜蘆醇干預后CTSK、MMP9、TRAP、 LC3、P62和Beclin-1的mRNA表達增加，加入3-MA后可抑制其表達；10 μmol/L白藜蘆醇和3-MA抑制其相關標志物mRNA表達。

2.6抑制自噬對自噬相關蛋白表達的影響

如圖6所示：加入3-MA后，自噬相關蛋白LC3II/I比值和Beclin-1的表達下降，蛋白P62的含量增加。3-MA可以完全抑制0.5 μmol/L白藜蘆醇對自噬的促進作用；10 μmol/L白藜蘆醇能抑制自噬，加入3-MA則進一步抑制自噬。

3 討論

破骨細胞來源于單核/巨噬細胞系，是由單核前體細胞融合形成TRAP陽性的多核巨細胞。RAW264.7細胞是小鼠源性破骨前體細胞，RANKL誘導其產生破骨細胞是一種公認的比較成熟的體外培養破骨細胞的方法，具有均一性好，獲得破骨細胞數多，沒有其他分離、純化等方法產生的如成骨細胞等雜質細胞，更有利于針對破骨細胞研究的開展[12]。

本實驗中顯示0.1、0.5 μmol/L的RSV干預后TRAP染色陽性破骨細胞增多，而1、5和10 μmol/L RSV的TRAP染色陽性破骨細胞則逐漸減少，RT-PCR進一步證實了破骨分化相關標志物CTSK、MMP9、TRAP的mRNA表達水平呈相應變化。之前也有研究表明RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中加入1～10 μmol/L的白藜蘆醇，隨白藜蘆醇濃度增加TRAP染色陽性破骨細胞數目和組織蛋白酶K的表達逐漸降低；且其圖示結果顯示在0.3 μmol/L白藜蘆醇干預后TRAP染色陽性破骨細胞數目有輕微升高[13]。但也有研究顯示M-CSF和RANKL誘導小鼠骨髓提取的前體細胞向破骨細胞分化過程中，加入用虎杖飲片粉提取的白藜蘆醇0.1 μmol/L和1 μmol/L干預后TRAP染色陽性破骨細胞數目減少[14]。與本研究結果相反，可能是由于白藜蘆醇為其自行提取，藥物純度、分離技術和用于誘導破骨細胞分化的前體細胞不同所致。近年來的研究顯示白藜蘆醇干預直接抑制破骨細胞的分化，但干預濃度多在1～10 μmol/L之間。本研究顯示更低濃度的白藜蘆醇可以促進破骨細胞的分化，對白藜蘆醇只抑制破骨細胞分化有了新的認識。

本研究觀察到0.1 μmol/L和0.5 μmol/L的白藜蘆醇促進破骨細胞的分化的同時，自噬水平逐漸增高；隨白藜蘆醇濃度升高破骨細胞分化和自噬水平下降。提示白藜蘆醇可能是通過調節自噬影響破骨細胞的分化。為進一步驗證白藜蘆醇對自噬的影響，選取0.5 μmol/L和10 μmol/L白藜蘆醇加入自噬抑制劑3-MA，顯示抑制自噬水平可以抑制0.5 μmol/L白藜蘆醇對破骨細胞分化的促進作用；且抑制自噬可以進一步抑制10 μmol/L白藜蘆醇對破骨細胞的分化。說明白藜蘆醇可能是通過調節自噬影響破骨細胞的分化。有研究顯示白藜蘆醇能上調Sirt1的表達水平，進而上調FoxO1蛋白表達抑制破骨細胞的分化[15]。也有研究顯示RSV降低TRAP染色陽性破骨細胞數并抑制細胞內ROS生成，表明RSV對破骨細胞分化的抑制作用是通過清除ROS介導的[13]。由此可見白藜蘆醇通過調節Sirt1、ROS和FoxO1等多種信號通路調節破骨細胞的形成。而研究表明Sirt1、ROS和FoxO等與自噬之間相互作用形成復雜的信號網絡，Sirt1可以通過對自噬基因Atg5、Atg7、Atg8等自噬誘導網絡的關鍵成分的去乙酰化直接影響自噬，細胞核定位的Sirt1還可以通過激活FoxO轉錄因子家族成員來誘導自噬通路組分的表達，乙酰化的FoxO1可以在細胞質中與Atg7結合并直接影響自噬。ROS的相對過量積累導致氧化應激可以促進自噬的形成，自噬通過吞噬和降解氧化物質，進而降低氧化損傷，自噬也可以通過伴侶介導的自噬、有絲分裂、P62傳遞等多種途徑調節ROS水平[16-17]。因此白藜蘆醇可能通過調節Sirt1、ROS、FoxO影響自噬從而影響破骨細胞的分化，其相互作用和分子調控機制還有待進一步研究。

綜上所述，RANKL誘導RAW264.7細胞向破骨細胞分化過程中，白藜蘆醇濃度在0.1～10 μmol/L范圍內，破骨細胞分化和自噬水平先升高后降低，抑制自噬可以抑制破骨細胞的分化。白藜蘆醇影響破骨細胞分化可能部分是通過調節自噬發揮作用，有望為白藜蘆醇治療骨質疏松提供新的作用靶點，但其具體的作用機制還有待進一步的研究。