姜黃素藥物代謝動力學評價與抗卵巢癌藥效作用模擬分析

謝海源，黃 巍，唐亞平，李 清，陸青玉，何美英，范 蓉

廣西中醫藥大學基礎醫學院，南寧 530200

中藥姜黃形似姜、色黃，性溫，味辛苦，歸肝、脾經，具有行氣散滯、活血化瘀之功效，主要含有姜黃素類成分、揮發油類成分等，現代研究表明姜黃具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降血糖、抗病毒等多種藥理活性[1]。姜黃素是中藥姜黃中最重要的抗癌物質之一，是從姜黃根莖中提取得到的黃色色素，其母核結構為二苯基庚烴，能靶向多個腫瘤基因蛋白、多條腫瘤相關信號通路，有望治療癌癥等惡性疾病[2]。姜黃素抗卵巢癌效果顯著，已引起國內外專家學者的廣泛關注，Pang等[3]利用流式細胞術檢測發現姜黃素能明顯抑制卵巢癌的細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡。目前多項針對姜黃素類化合物的抗腫瘤研究已進入臨床試驗階段，因此靶向姜黃素的制藥研究，具有良好的應用前景和可行性。

現代醫學研究表明卵巢癌等惡性腫瘤疾病，是由多種遺傳、非遺傳因素，多個靶點、通路引起的復雜性疾病，而中藥活性成分往往具有多靶點、多功效的藥理作用特點，傳統的“一個靶點，一種疾病，一個藥物”的研究模式，已很難系統、整體地闡明中藥活性成分對復雜疾病的藥理作用機制[4]。隨著計算機輔助藥物設計和分析等新理念的相繼提出，為中藥及其活性成分研究帶來了新的技術與方法，其系統性、整體性的研究理念與中藥活性成分多靶點、多途徑、協同作用等特點不謀而合。本研究基于計算機模擬分析的研究思路與方法，從系統網絡層面研究姜黃素對卵巢癌細胞增殖能力的影響，規避傳統實驗研究的盲目、不系統、耗費高、耗時長等弊端，有助于揭示姜黃素分子生物學藥理機制。

1 材料與方法

1.1 活性成分選取

在Chemicalbook數據庫(https://www.chemicalbook.com)獲取姜黃素三維結構等信息，并利用ChemBio3D Ultra 14.0軟件的MM2下的Minimize Energy模塊將姜黃素結構能量最小化。

1.2 藥物代謝動力學評價

用SwissADME服務器分析姜黃素原型的藥代動力學參數，探討姜黃素的成藥性、血腦屏障透過率、胃腸吸收、以及肝藥酶抑制等藥物代謝動力學參數。

1.3 姜黃素靶點預測

本研究通過數據庫檢索和分子構效關系找靶兩種策略，挖掘姜黃素潛在的作用靶點。首先，將姜黃素導入STITCH化合物-靶蛋白關聯網絡數據庫(http://stitch.embl.de/)，設置參數為“highest confidence = 0.9”高置信度，利用數據庫挖掘的方法尋找姜黃素潛在靶點。其次，利用SwissTarget Prediction靶點搜尋服務器(http://www.swisstargetprediction.ch/)，基于姜黃素分子結構，反向尋找其潛在藥效靶點。最后，將兩種方法挖掘的得到的靶點整合，建立姜黃素潛在靶點集合。

1.4 卵巢癌相關基因集合的構建

運用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數據庫檢索獲取卵巢癌相關基因。將以上數據庫獲取的卵巢癌基因按照相關程度打分score值從高到低排列，依次取評分高的前100個基因，篩除重復后合并，構建卵巢癌基因集合。

1.5 姜黃素靶點-卵巢癌基因關聯網絡構建

利用STRING數據庫構建“姜黃素靶點-卵巢癌基因”相互作用網絡，定義來源為“Homo sapiens”(智人)進行分析，最低相互作用閥值設為“medium confidence = 0.4”中等。網絡拓撲參數度值(degree)、介數(betweenness)、最短路徑(closeness)中心性是判斷一個網絡節點重要性的三個主要拓撲參數，度值、介數、最短路徑越大，節點在該網絡就越重要。本研究以度值、介數、最短路徑的“中位數”為臨界值，篩選出臨界值以上的抗卵巢癌靶點，確定為姜黃素抗卵巢關鍵靶點，進行下一步研究。

1.6 KEGG通路研究

利用DAVID v 6.8服務器對姜黃素關鍵抗卵巢癌靶點進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，篩選出P-value<0.05的癌癥通路，研究其抗卵巢癌通路與作用途徑。

1.7 靶點分子對接驗證

用分子對接服務器SystemsDock和分子對接軟件Autodock vina驗證姜黃素與主要抗卵巢癌靶點的親和力大小。SystemsDock是基于Autodock vina分子對接算法的一款高精度對接服務器，運算速度快、準確率高。對接打分(docking score)值代表了配體與受體的親和力情況，其中docking score<4.25說明分子和靶標親和力不強，docking score>4.25說明分子和靶標有中等親和力，docking score>5說明分子和靶標有較強的親和力，docking score>7說明分子和靶標有強烈的親和力。

2 結果

2.1 姜黃素藥物代謝動力學評價

將姜黃素SMILES代碼導入SwissADME服務器，分析了姜黃素原型的藥代動力學參數。如表1、圖2所示，姜黃素基本符合Lipinski類藥五原則，具有較好的成藥性和一定的胃腸吸收性，但不能通過血腦屏障，且非P-糖蛋白底物。姜黃素對肝藥酶CYP2C9、CYP3A4具有一定抑制性，對CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6未表現抑制活性。

續表1(Continued Tab.1)

類別Category姜黃素參數Curcuminparameter標準值Standardparameter血腦屏障Blood-brainbarrierpermeant否無胃腸吸收Gastrointestinalabsorption高無P-糖蛋白底物P-glycoproteinsubstrate否無極性TopologicalpolarsurfaceareaTPSA=93.06?220?2

圖1 姜黃素的藥代參數

圖2 姜黃素的潛在靶點

2.2 姜黃素靶點預測

如圖2所示，利用SWISS服務器和STITCH服務器分別預測得到14個和31個姜黃素潛在靶點，其中重復靶點有2個。姜黃素潛在靶點種類廣泛，包括TP53原癌基因、CASP3凋亡基因、HIF1A、AR等細胞因子和激素等，表現出明顯的多靶點效應。

2.3 姜黃素靶點-卵巢癌基因網絡

以“ovarian carcinoma”為關鍵詞，分別在GeneCards、DisGeNET和OpenTargets數據庫搜索與卵巢癌相關的靶基因，提取三個數據庫相關分數前100的靶基因并篩除重復，得到174個相關的卵巢癌基因。利用STRING數據庫，將43個姜黃素靶點與174個卵巢癌基因構建關聯網絡。如圖3所示，姜黃素靶點與卵巢癌基因能構成了復雜關聯網絡、含3 753條關聯連線，涉及到基因融合、基因共表達等多種關聯關系。

圖3 姜黃素靶點-卵巢癌基因關聯網絡

表2給出了姜黃素的主要抗卵巢癌癌靶點及網絡數據。可以看到，網絡的度值中數為42、介數中數為2.47×10-3、最短路徑中數為5.29×10-1。如表2所示，共得到17個姜黃素靶點，度值、介數、最短路徑均大于中數“臨界值”，以其為姜黃素抗卵巢癌的關鍵靶點，進行下一步研究。

表2 姜黃素的主要抗卵巢癌癌靶點及網絡數據

續表2(Continued Tab.2)

靶點Target度值Degree介數Betweenness最短路徑ClosenessPTGS2634.47×10-35.74×10-1MMP9693.53×10-35.74×10-1MMP2643.41×10-35.68×10-1CCNE1502.47×10-35.55×10-1

2.4 KEGG通路富集

表3和圖4給出了姜黃素17個抗卵巢癌關鍵靶點的KEGG通路富集結果，可以看到6大類16條與癌癥密切相關的KEGG通路(P-value<0.01)被篩選出。具體包括：①腫瘤血管生成相關的缺氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路；②腫瘤浸潤轉移相關的黏著斑(focal adhesion)、黏著斑連接(adherens junction)通路；③腫瘤細胞凋亡相關的p53信號通路、凋亡通路；④腫瘤免疫相關的腫瘤壞死因子(TNF)通路；⑤雌激素通路；⑥腫瘤細胞增殖相關的Cell cycle、PI3K/Akt、Ras、MAPK、ErbB、Jak-STAT、Wnt、FoxO、Rap1等通路。富集結果顯示，姜黃素可能通過調節以上KEGG通路，發揮抗卵巢癌的作用。

表3 KEGG通路

圖4 KEGG信號通路富集

2.5 靶點驗證

利用SystemsDock服務器對姜黃素和17個關鍵抗卵巢癌靶標進行分子對接。從表4可知，姜黃素與17個抗卵巢癌靶標分子的對接分數均大于4.25，姜黃素與EGFR、TP53、AKT1、ERBB2、CASP3、MTOR、STAT3、HIF1A、MMP2、PTGS2等17個靶標均屬于有效結核，良好的親和活性也體現了本研究的可靠性。就其中第一個靶點EGFR為例，圖5給出了EGFR抑制劑W2R和姜黃素分子對接對比，從圖可以看出姜黃素與EGFR抑制劑W2R作用情況基本類似，能有效結合與EGFR的活性中心，與Leu718、Phe723、Val726、Ala743、Lys745、Met766、Thr790、Met793、Leu844、Thr854、Asp855、Phe856、Gly857等關鍵的氨基酸殘基相互作用，從而抑制EGFR活性達到抗腫瘤的藥理效果。

表4 姜黃素分子對接結果

續表4(Continued Tab.4)

核心靶標KeytargetPDB編號PDBID對接打分DockingscoreCASP33GJQ5.126??STAT34ZIA8.212???MTOR4JSV4.716?IGF1R2OJ94.479?HIF1A1H2M4.788?AR2PIX7.876???PTGS25F196.269??MMP95TH66.538??MMP21RTG6.112??CCNE15L2W6.378??

注：***非常強相互作用；**強相互作用；*中等相互作用。

Note:***Very strong interaction;**Strong interaction;*Medium interaction.

圖5 EGFR抑制劑W2R和姜黃素分子對接對比

3 討論

卵巢癌的病死率位于婦科腫瘤疾病首位，其發病率位于女性生殖系統腫瘤第三位[5]，目前國際公認的卵巢癌一線化療方案是TC(紫杉醇+卡鉑)和TP(紫杉醇+順鉑)方案。由于現有方案療效有限，化療藥物存在惡心嘔吐、骨髓抑制、肝腎損害等毒副作用，嚴重影響了患者的預后和生存質量[6]，因此開發研究新一代高效低毒抗腫瘤藥物勢在必行。

中藥小分子活性物質——姜黃素，能從多個靶點、多個途徑實現抗腫瘤作用，已經得到許多實驗的證實，研究中藥小分子的藥代動力學參數、P-糖蛋白轉運和肝藥酶影響，有助于明確中藥小分子與其他臨床藥物的相互作用和耐藥性等，對提高臨床用藥有效性和安全性大有裨益。研究[7]表明姜黃素口服不易吸收，生物利用度低，但對其是否可能通過P-糖蛋白轉運、是否影響肝藥酶的活性不甚了解，而且對其生物利用度等缺乏具體的數據可考。

本研究發現，姜黃素基本符合Lipinski的類藥五原則，具有較好的成藥性和一定的胃腸吸收性，但不能通過血腦屏障，且非P-糖蛋白底物。另外，姜黃素對肝藥酶CYP2C9、CYP3A4具有一定抑制性，對CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6不具有抑制性。Zhang等[8]建立血腦脊液屏障模型，發現姜黃素為血腦脊液屏障低滲透性藥物，通過性較差；Hou等[9]發現姜黃素能抑制CYP3A4的表達；Volak等[10]發現姜黃素對CYP1A2、CYP2D6等肝藥酶的影響較小，這些均與本研究結果一致。可見，用計算機模擬來分析中藥小分子藥代動力學參數，真實性良好、為后續合理開發姜黃素生物藥劑提供了參考。

模擬分析表明，姜黃素能直接、間接的調控TP53、CASP3、EGFR、ERBB2、AKT1、MTOR、STAT3、MMP2、MMP9、HIF1A、PTGS2、CCND1等17個卵巢癌相關基因，實現多靶點抗腫瘤效果。Yuan等[11]通過Western blot法檢測腫瘤細胞p53(TP53)和caspase-3(CASP3)的表達，發現姜黃素作用48 h后能明顯提高腫瘤細胞p53和活化caspase-3含量，誘導腫瘤細胞的凋亡。EGFR與ERBB2均為表皮生長因子受體家族成員，其異常激活能促進SKOV3卵巢癌細胞的惡性增殖[12]，Yang等[13]發現姜黃素能促進卵巢癌細胞凋亡，其機制與下調EGFR表達相關。Zhang等[14]發現姜黃素能降低Akt、mTOR(MTOR)蛋白表達水平，抑制T2卵巢癌細胞株增殖，其8 h的IC50為21.2μmol/L。Duan等[15]通過Western blot方法發現姜黃素衍生物能抑制STAT3及基質蛋白酶MMP2、MMP9的表達，劑量依賴性的抑制卵巢癌SKOV3細胞的侵襲和轉移。HIF-1α是治療惡性腫瘤的一個新的靶點，Wan等[16]利用ELISA檢測發現姜黃素能抑制人胰腺癌HIF-1α發揮抗腫瘤作用，提示姜黃素可能通過調控HIF1A發揮相似的抗卵巢癌作用。Pan等[17]報道了姜黃素能調控環氧酶2(PTGS2)、G1/S-特異性周期蛋白Cyclin D1(CCND1)、EGFR等抑制卵巢癌的增殖發展。總之，本研究通過關聯網絡篩選出的姜黃素關鍵抗卵巢癌靶點與當前許多研究相互佐證，說明姜黃素能通過調控以上“多靶點”來實現抗卵巢癌的作用。

對姜黃素17個核心抗卵巢癌靶標進行KEGG通路富集研究，發現姜黃素能調控腫瘤血管生成、腫瘤浸潤轉移、腫瘤細胞凋亡、腫瘤免疫、雌激素通路、腫瘤細胞增殖發展等6大類16條信號通路，發揮多途徑抗卵巢癌的藥理作用。Li等[18]研究發現姜黃素具有抗腫瘤血管的作用，主要是通過HIF-1α、VEGF等途徑實現的。Liu等[19]研究表明姜黃素能通過調節黏著斑蛋白含量，抑制腫瘤細胞的遷移、轉移，實現抗腫瘤浸潤轉移的作用。說明姜黃素具有抗腫瘤血管生成、抗浸潤轉移的作用，且與本研究富集的HIF-1α、黏著斑(focal adhesion)、黏著斑連接(adherens junction)通路相符。Fu等[20]發現姜黃素能通過p53通路調控腫瘤細胞的自噬、凋亡、擴散；Lin等[21]通過實驗表明姜黃素能降低TNF-α等免疫因子含量，促進腫瘤細胞凋亡；與本研究的富集結果相似，表明姜黃素能通過調控p53通路、調控免疫因子TNF-α，誘導腫瘤細胞的凋亡。本研究還發現姜黃素能調控Cell cycle、PI3K/Akt、Ras、Rap1、MAPK、ErbB、Jak-STAT、Wnt、FoxO等與腫瘤細胞增殖密切相關的信號通路。Wang等[3]綜述報道了姜黃素能靶向p53、Ras、PI3K、AKT等信號通路，具有良好的抗癌效果、且幾乎無不良反應。Wang等[22]通過生物信息學技術發現姜黃素主要是通過調控MAPK通路，抑制卵巢癌的發生和發展。Liu等[23]利用熒光素酶檢測和免疫印跡技術，發現姜黃素有很強的STAT3信號通路抑制作用，能抑制腫瘤細胞的生長增殖。Zhu等[24]發現Wnt信號通路能介導姜黃素抑制顯著腫瘤細胞的增殖分化，臨床治療腫瘤效果確切。Zhang等[25]在研究中發現姜黃素不僅能抑制Akt信號通路活化，還對Akt下游的FoxO信號通路有明顯的抑制作用，從而抑制腫瘤細胞活性。綜上，姜黃素能通過多條信號通路抑制卵巢癌細胞的增殖發展。為明確本研究靶點的準確性，在SystemsDock服務器對17個關鍵抗卵巢癌靶標進行分子對接，發現姜黃素與17個靶標均有較好的親和力，說明本研究靶標預測準確可靠，也進一步反應了本研究關聯網絡、KEGG通路富集以及最后結果結論的可靠性。

綜上，本研究通過計算機模擬分析技術，研究了姜黃素的基本藥動學參數，發現其成藥性良好；姜黃素能作用于17個核心抗卵巢癌靶標、調控6大類16條抗卵巢癌信號通路，發揮多途徑抗卵巢癌藥理作用，具有“多靶點-多通路-多途徑”抑制卵巢癌的的良好藥理作用。本研究為后續姜黃素藥理作用機制的探討以及新型藥劑的開發提供了參考。